李子蜂花粉中黄酮苷及酚胺类化合物鉴定

张勇 王莉 乔江涛

（1江苏蜂奥生物科技有限公司，泰州225312；2江苏鸿祺生物科技有限公司，泰州225312；3中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

花粉是显花植物花药产生的雄性生殖细胞，通常由蜜蜂、蝴蝶、飞蛾、蜂鸟等传粉者传递到雌花的柱头上[1]。蜜蜂是水果、蔬菜、花卉和农作物最重要的传粉者，世界上超过三分之一的农作物生产依赖于蜜蜂授粉[2]。花粉提供了蜂群生长发育所需的营养，还有助于蜜蜂降低对杀虫剂的敏感性，增强蜜蜂的免疫功能，并帮助蜜蜂对抗病原体，如微孢子虫、细菌和病毒[3]。

由于蜂花粉营养价值和生物活性，它已经在人类的饮食中使用许多世纪。近年来，蜂花粉作为人类膳食补充剂被广泛应用于食品加工中[3]。建议每天摄入花粉，因为它对人体健康有益，如有助于减缓衰老过程，降低胆固醇水平，调节肠道功能，对心血管系统、皮肤和视力有好处，而且具有抗生素、抗癌和抗氧化生物活性。花粉在医学上最重要的用途是它对前列腺疾病的预防和治疗作用[4]。蜂花粉作为前列腺疾病的主流药物，从1988年开始在中国市场广泛使用。蜂花粉的这些功能特性主要是由于其含有多种生物活性化合物，如蛋白质、碳水化合物、粗纤维、氨基酸、维生素、矿物质和脂肪酸，以及植物次生代谢产物。植物化学物质作为植物的代谢物，广泛存在于蜂花粉中[1]。以往的研究主要集中在花粉中的酚酸和黄酮类化合物，尤其是对香豆酸、山奈酚、槲皮素和异鼠李素等具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌和抗氧化等[5]。近年来，蜂花粉中的另一种生物活性物质多胺逐渐引起人们的关注。多胺通常在花粉中与羟基肉桂酸结合。这些成分通常被命名为羟基肉桂酸酰胺（HCAA）衍生物或酚酰胺。蜂花粉中的酚酰胺具有结构多样性的特点，其主要成分是酚类物质（对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸）与脂肪族或芳香族胺结合，如腐胺、精胺和亚精胺[6]。然而，不同植物的花粉代谢途径不同，造成酚酰胺的种类不同的单花蜂花粉中表现出很大的差异。

本文采用高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry,HPLC-QTOF- MS），对李子蜂花粉中的黄酮苷和酚胺类化合物进行结构鉴定为蜂花粉的生物活性及药理学作用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

分析级甲醇、无水乙醇、甲酸购自北京索莱宝科技有限公司；色谱级甲醇、乙酸，质谱级乙酸购自美国Fisher公司；实验用水为超纯水。

1.2 实验材料

李子蜂花粉样品于2020年采自广西，样品采集后存放于4℃冰箱备用。

1.3 实验仪器设备

离心机（美国Thermo Fisher公司）；无菌注射器（江苏正康医疗器械有限公司）；0.22μm 微孔滤膜（Milipore 公司）；移液器（美国Thermo Fisher公司）；数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；LC-6AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；高效液相色谱仪和6520 四级杆-飞行时间质谱（美国Agilent 公司）；JECHERS自动样品制备系统（上海净信实业发展有限公司）；

1.4 方法

1.4.1 蜂花粉样品前处理

准确称取3g蜂花粉置于50ml离心管中， 75%乙醇溶解并定容至30ml。自动样品制备系统条件：频率120Hz，运行时间60s。蜂花粉悬浊液配平后在6000r/min条件下离心5min，取上清过0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC分析。

1.4.2 高效液相色谱分析条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18(150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速：0.65 ml/min；流动相A：0.2%乙酸水流动相B：2%乙酸甲醇，进样量为10μl、检测波长270nm；柱温箱温度为38℃。

梯度洗脱程序为：0～10min，10%～22% B；10～16min，22%～28%B；16～30min，28%～31%B；30～47min，31%～34%B；47～75min，34%～43%B；75～108min，43%～45%B；108～110min，45%～51%B；110～145min，51%～59%B；145～150min，59%～80%B。

1.4.3 样品质谱分析条件

液相质谱（LC-QTOF）分析条件：离子源为ESI源（电喷雾），离子源喷射电压为4kV，出口电压为130V、加热的温度350℃、氮气（N2）流速为11L/min、碰撞气体为氦气、雾化气流速为80kPa、雾化器的压力40psi、质量扫描范围m/z =100～900Da。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉高效液相色谱图

李子蜂花粉提取物经HPLC分离结果如图2所示，从图中，可以清楚的看到油菜蜂花粉中所含物质丰富，出峰时间紧凑，分别 在25min、40min和105min 成簇出现，对图1所示所有峰进行出峰时间和紫外光谱对比。根据文献查阅对比、HPLC-MS鉴定数据对比及标品验证，对图1标注结果化合物1和化合物2进行鉴定，结果如表1。

图1 李子蜂花粉

表1 正离子模式下李子蜂花粉中化合物信息

2.1.1 化合物 1结构解析

图3及表1为化合物正离子模式下二级质谱图，可知化合物1的准分子离子峰[M+H]+m/z 641.3537，化合物1的分子量为640Da。通过比对图2二级质谱数据断裂碎片，进一步推测化合物裂解途径论证该化合物结构，其表现为显著的多酚类化合物的电离特征。准分子离子峰[M+H]+（m/z）在断裂1个葡糖苷（C6H5O10）碎片后，产生分子离子碎片峰[M+H]+m/z 479.1346，而后在第二次相继断裂1个葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子离子碎片峰 [M+H]+m/z 317.0770，最终得到相对分子质量317Da即为异鼠李素相对分子质量。结合紫外光谱，化合物1在328nm、354nm处有最大吸收峰，符合多酚类紫外吸收特征。化合物我们最终鉴定为异鼠李素-3-O-龙胆二糖糖苷。

图2 李子蜂花粉HPLC 谱图

图3 正离子模式下化合物1的质谱图（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.2 化合物2结构解析

图4及表1为化合物正离子模式下二级质谱图，可知化合物2的准分子离子峰[M+H]+m/z 611.1531，因此化合物2的分子量为610 Da。通过比对图4二级质谱数据断裂碎片，进一步推测化合物裂解途径论证该化合物结构。其表现为显著的多酚类化合物的电离特征。准分子离子峰[M+H]+(m/z)在断裂1个葡糖苷（C6H5O10）碎片后，产生分子离子碎片峰[M+H]+m/z 449.1024，而后在第二次相继断裂1个葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子离子碎片峰 [M+H]+m/z 287.0510，最终得到相对分子质量288Da即为山奈酚相对分子质量。结合紫外光谱，化合物2在348nm处有最大吸收峰，符合多酚类紫外吸收特征。化合物我们最终鉴定为山奈酚-3-O-槐糖苷。

图4 正离子模式下化合物2的质谱图（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.3 化合物3、4、5、6结构解析

从表1中可知，化合物 3、4、5和6相对分子质量相同，均为583，四个峰二级质谱断裂相同，表明四个化合物为异构体。由图5可知道，准分子离子峰584m/z[M+H]+在断裂一个香豆酰碎片（-146）后，产生碎片离子438m/z[M+H]+，而后继续断裂一个香豆酰碎片（-146）产生碎片离子292m/z[M+H]+。此外，四个化合物的保留时间之间增长，最大紫外吸收逐渐增大，表明四个化合物可能是顺反异构体。由于反式香豆酰属于平面型结构，双键与处于同一平面的苯环容易形成Π-Π共轭。对于顺式香豆酰，由于空间位阻，造成双键与苯环处于非平面，不易发生共轭，而顺式与反式的紫外最大吸收波长略有不同，与顺式相比，反式的最大吸收波长位于长波端。另外，顺式异构体是两个电负性相同的原子或原子团处在分子的同侧，造成偶极矩的叠加，增加不对称性，不像反式那样比较对称地排列，因而顺式分子的偶极距比反式大，为偶极分子，有较弱的极性。

图5 正离子模式下化合物6的质谱图（LC-QTOF-MS/MS）

图6 化合物6的质谱断裂图

最后化合物峰3、4、5、6分别被鉴定为顺, 顺, 顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺,顺, 反-三-对-香豆酰亚精胺、反, 顺, 反-三-对-香豆酰亚精胺和反, 反, 反-三-对-香豆酰亚精胺。化合物6的质谱断裂规律。

3 讨论与结论

本研究采用HPLC-QTOF-MS法，从李子蜂花粉中鉴定出2个黄酮苷类化合物，分别是异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷和山奈酚-3-O-槐糖苷。此外首次从李子蜂花粉中鉴定出4个酚胺类成分，分别是 顺, 顺, 顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺, 顺, 反-三-对-香豆酰亚精胺、 反, 顺, 反-三-对-香豆酰亚精胺和反,反, 反-三-对-香豆酰亚精胺。本研究对李子蜂花粉的功能活性研究提供理论参考。