诱发支气管哮喘动物模型气道重塑特征的方法和评价

何婷钱佩瑶洪敏刘成勇郑劼

(1.南京中医药大学药学院 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,南京 210023;2.南京中医药大学附属医院,南京 210029;3.南京中医药大学医学院·整合医学学院,南京 210023)

哮喘是世界上最常见的呼吸系统疾病之一,全球约有3亿人在接受治疗。这带来了巨大的经济负担,其全球经济耗费超过结核病和艾滋病的总和[1]。临床治疗使用糖皮质激素、β2受体激动剂、抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂和茶碱类药物,这些药物在急性期缓解哮喘发作上取得显著效果,但长期应用后疗效下降,使得哮喘的发病率和死亡率不仅没有降低,反而呈现上升的趋势,提示上述药品对于哮喘急性期缓解控制疗效明显,但不可长期应用,无法根治[2]。气道重塑是哮喘反复发作和不完全可逆性的主要原因,也是难治性哮喘的主要病理基础之一。所以建立合适的气道重塑模型对治疗药物的筛选以及药物效应评价具有重要意义。

《2009年全球哮喘协议》[3]将哮喘定义为多种细胞和细胞因子参与的一种气道的慢性炎症,将导致呼吸困难、胸闷和咳嗽,以及反复发作。这些病症与肺内气流阻塞有关,这种阻塞通常是可自发或经治疗后逆转的,但随着病程的延长可导致气道结构发生改变,而不可逆转。这种病理现象称为气道重塑—表现为气道壁增厚、管腔狭窄、气流受限。涉及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积、气道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)增厚、上皮下纤维化、肌成纤维细胞增生、炎症细胞浸润、杯状细胞增生等[4]。

哮喘是一种独特的人类疾病,动物与人之间存在巨大的种属差异,所以常用的模型并不能完全反映人体真实的病变特点,需要根据研究目的选择合适的动物造模。现将国内外有关支气管哮喘气道重塑动物模型的构建进行比较分析。

在PubMed数据库(2015～2020)查找关键词“airways remodeling”和“asthma”,并限定为“other Animals”,共得到270篇文献,部分文献尚未标明自己所采用的动物的性别。以下将针对不同种类动物模型的构建进行分析评价。

1 支气管哮喘气道重塑模型

常用过敏性哮喘模型的建立分为两个阶段,第1阶段是致敏,抗原刺激B细胞后,产生IgE可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和受体FcεR1结合[1],使动物致敏。第2阶段是激发,再次接触到抗原后,气道中的效应细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)将通过FcεR1激活,迅速引发超敏反应。在两个IgE分子同过敏原交联后[2],这些效应细胞释放预先形成且能快速合成的递质,例如组胺,导致支气管痉挛,水肿和分泌粘液,大量粘液堵塞会导致气流不畅。同时,上皮细胞转化为间质细胞,气道外基质沉积,气道平滑肌增厚,上皮纤维化,胶原蛋白沉淀,进而导致气道重塑。所以建立动物模型时分为两个阶段,致敏期和激发期。常用的方法在致敏期腹腔注射过敏原,在激发期用雾化的方法激发,使用的抗原包括屋尘螨(HDM)、卵清蛋白(OVA);佐剂包括氢氧化铝、氢氧化镁、硫酸铝钾。

2 气道重塑模型的实验动物种属

2.1 小鼠气道重塑模型

小鼠免疫遗传背景较为清楚,小鼠基因组与人类基因组有着90%以上的相似性,因此小鼠常被用作构建哮喘模型。根据种属不同,可分为BALB/c小鼠,C57BL/6小鼠。小鼠造模的优点如下,实验成本较低,造模方法较为成熟,可选择种系较多[5]。但也存在以下缺点,小鼠造模后形成的肺部的炎症与人类哮喘病理特征不同[6],小鼠造模后晚期非生理性支气管狭窄[5],此外,它对过敏原易产生耐受性[7]。BALB/c小鼠的特点,体积小、繁殖能力强[8]、免疫系统与人类接近,BALB/c小鼠易对OVA和花粉致敏产生气道高反应性和明显IgE超敏反应[9],因此选用OVA为过敏原时,多选用BALB/c小鼠。C57BL/6小鼠对屋尘螨(HDM)和OVA均敏感,C57BL/6小鼠用OVA作为致敏原构建哮喘模型[10]后,小鼠出现明显的呼吸急促、哮鸣音、腹肌抽搐、烦躁及口唇紫绀等典型的哮喘症状,但并未形成气道重塑,因此C57BL/6小鼠可能不适用于气道重塑模型的建立。临床研究发现,哮喘在女性中发病率高于男性。也有文献表明在接受OVA刺激后,雌性小鼠同雄性小鼠相比能产生更强烈的过敏性炎症反应[11]。此外,在IL-13和OVA的联合刺激下,同雄性小鼠相比,雌性小鼠表现出更加强烈的Th2型反应[12]。

2.2 大鼠气道重塑模型

Wistar大鼠与SD大鼠,两种品系的雌雄大鼠都曾用作哮喘造模,造模后的过敏反应由IgE介导,产生迟发型过敏反应的时间与临床患者相似,大鼠价格便宜,能获得大量的肺泡灌洗液。雄性SD大鼠较多使用,可能是因为其耐受性强,能够长时间耐受高浓度的雾化激发,最终出现典型过敏性炎症反应[13]。但使用大鼠造模也有局限性,主要是缺乏相关的分子生物学试剂,且易对过敏原产生耐受性。

2.3 豚鼠气道重塑模型

豚鼠是常用的呼吸道过敏性疾病的模型动物。因为它们肺部在解剖学、药理学和生理学上与人类具有相似之处[14]。与上述哮喘的啮齿动物模型一样,豚鼠对OVA敏感,易诱发与哮喘患者相似的炎症反应,其中包括嗜酸性粒细胞增多和气道反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)增强[15],能产生典型的Ⅰ型变态反应,雾化激发后能产生速发型与迟发型哮喘反应。豚鼠模型的缺点主要是豚鼠的变态反应由IgG而非IgE介导。造模后的豚鼠不会出现气道重塑,以及对OVA个体反应差异大,部分豚鼠可能不出现哮喘反应,而少数豚鼠可能会发生急性过敏性休克而死亡[15]。此外,缺乏相关的分子生物学试剂,价格昂贵也使得豚鼠不是气道重塑模型构建的理想动物。

3 根据过敏原分类建立气道重塑模型

分析前文筛选的的文献,报道表现出气道重塑的病理特征,按致敏原分类分为以下2类。

3.1 OVA用作致敏原的致敏方法

致敏期操作相同,均为腹腔注射OVA致敏,激发期操作分别为:(1)OVA雾化激发;(2)OVA滴鼻激发;(3)OVA刺激咽喉;(4)OVA雾化,激发结束后连续3 d用RSV(呼吸道合胞病毒)刺激。

3.2 HDM用作致敏原的致敏方法

选用的不同致敏原分类:(1)腹腔注射HDM致敏,HDM滴鼻激发;(2)气管注射HDM致敏,HDM滴鼻激发。

根据选用的不同致敏原分类后,又按造模时间分类。我们将小鼠致敏期与激发期总时间少于6周的定义为急性模型,表现为在停止激发后,气道重塑等病理变化可以恢复。大于6周的定义为慢性模型。表现为在停止刺激后,气道重塑等病理变化不可逆。各种造模方法的详细信息如表1所示,比较各种造模方法所致的气道重塑相关病理表现,以及病理变化的持续的时间。

表1 用不同的过敏原刺激构建哮喘的气道重塑模型的方法Table 1 Airway remodeling model of asthma with different allerge

续表1

按上述的分类方法,总结为以下几类:(1)长期造模,腹腔注射OVA(溶于Al(OH)3中)致敏,OVA雾化激发,采用此方法的共有3篇文献[16-18],两篇文献的致敏剂量为20μg,雾化时则采用浓度为1%。其中一篇文献[17]在造模结束后14 d检测了AHR,气道重塑,粘液分泌,胶原蛋白沉淀等气道重塑相关病理机制,仍然尚未恢复到基线值。(2)短期造模,腹腔注射OVA致敏,OVA雾化激发,8篇文献[19-26],致敏时的OVA给药量最高为25 mg,其他小鼠均使用10μg或者20μg OVA进行致敏,而大鼠用1 mg或者10 mg的OVA进行致敏,致敏次数在2～3次;激发期用的OVA浓度范围在1%～5%。上述两种模型最主要的区别在于激发期的激发次数,因此表现出不同的病理特征。(3)长期造模,腹腔注射OVA致敏,OVA滴鼻激发,采用此方法的共有3篇文献[27-29],致敏过程如Balkrishna等[27]OVA给药量为D0(25μg)D7(100μg),激发过程中用100μg OVA进行7次刺激;Yang等[28]两次均为100μg,用100 ng进行5次刺激。Chen等[29]致敏过程均给与100μg OVA,后给予100μg进行激发,共18次。(3)短期造模,共有2篇文章[30-31]分别采用5、100μg进行致敏后连续5 d 50μg OVA滴鼻激发,或者10μg OVA咽喉刺激激发。

我们发现,长期造模多选用OVA作为抗原,慢性模型更能模拟人体哮喘的特点,主要表现为Th2型细胞因子介导的过敏性炎症,包括嗜酸性粒细胞浸润,气道高反应性[35]。Luo等[16]采用20μg OVA溶于200μL含2.25 mg Al(OH)3溶液在D0、D7、D14进行腹腔注射致敏,D22～D77,连续8周,每周3次,每次30 min,用1%OVA进行雾化激发的方法。小鼠表现出气道重塑(气道壁增厚、上皮细胞纤维化、杯状细胞增生、分泌粘液、胶原蛋白沉淀)以及炎性细胞浸润,Th2型细胞因子增多。此外,在一些慢性哮喘模型中,气道高反应性(AHR)和肺部炎症在最后1次过敏原刺激后持续数天或数周,它们的维持情况因实验方案的不同而有所变化。

急性模型,Sharma等[20]用OVA(100μL,0.2 mg/mL溶于含2.25 mg Al(OH)3溶液中)在D1和D14进行腹腔注射致敏,在D28用OVA(20μL,5 mg/mL溶于saline中)激发,发现气道高反应性在24 h后上升,在48 h后,恢复到正常值。Kung等[36]腹腔注射OVA(500μL,0.016 mg/mL,2 mg Al(OH)3溶液中)在D0、D6致敏,然后用0.5%OVA在早晚各激发1次,时间为30 min。肺部的炎症在6周内完全消失。此外,急性期模型缺乏气道重塑等病理变化,包括上皮细胞纤维化,上皮细胞增生等现象[37]。

上述方法造出哮喘模型的气道重塑病理特征如表2所示:(1)用50μg HDM腹腔注致敏后,再用20μg HDM连续3 d滴鼻进行激发;(2)HDM气管注射1μg致敏后,先连续5 d用10μg HDM进行激发,再连续5周,每周3次激发;(3)用25μg HDM连续5周滴鼻。

表2 哮喘模型的气道重塑相关病理特征Table 2 Pathological characteristics related to airway remodeling in asthma models

急性模型在造模过程中,多采用高浓度的致敏原刺激[38],造成肺实质炎症,尤其是血管、小支气管的炎症,与人类哮喘的发展过程、病理表现不同。急性模型的缺点,在最后1次抗原刺激后的2周内,气道炎症和气道高反应性会消退[17]。肺部的炎症在6周内完全消失。

哮喘模型动物在分析哮喘的发病机制和病理生理学上有重要作用,本文比较不同实验方案中选择实验动物、过敏原、佐剂、致敏和激发时间的异同点。通过上述的急慢性模型分类比较,我们发现,急性模型造模周期短,短期内出现强烈的炎症反应,以及气道重塑,但在停止抗原激发后,2周内炎症反应就可恢复到基线值,气道重塑也会消退,所以不能较好地模拟人体哮喘的病理特征。而慢性模型的炎症反应和气道重塑在停止抗原激发的2周后,用OVA作为抗原的模型组同空白组相比,呼吸间歇值仍然存在显著性差异,提示其气道重塑仍然存在[17]。此外,Deng等[19]的造模方法,提示小鼠的气道壁增厚,同人类哮喘的病理表现—气道平滑肌增厚较为相似。如前文所述,哮喘的慢性模型更多地使用OVA作为抗原,BALB/c小鼠作为模型动物。因此,模拟以气道重塑为特征的慢性哮喘动物模型可选用雌性BALB/c小鼠,使用Luo等[16]的造模方法,D0、D7、D14腹腔注射20μg OVA溶于200 μL含2.25 mg Al(OH)3混悬液中,自D21起,用浓度为1%的OVA雾化,8周,每周3次,每次30 min。

我们的研究发现,小鼠是常用的模式动物,被广泛地应用到哮喘模型构建,实验成本较低,造模方法成熟。因此相应的抗体种类多,便于科学实验的展开。但是,小鼠因为体型较小,可供分析的样本量较少。大鼠也被用于构建哮喘模型,所提供的样本量较多,但相应的抗体种类较少,不利于开展部分科学实验。豚鼠也用于构建哮喘模型,且肺部结构与人体相似,但受制于抗体种类,对于大部分科学实验的进行都有限制。基于此,我们认为,使用小鼠构建哮喘模型,有益于科学实验的开展。

在研究哮喘发病机制的过程中,除上述涉及到的动物模型,还需要充分利用新的技术,包括组织培养技术和计算机建模等。这些方法为哮喘研究和药物研发提供新的思路,许多技术已经被开发来研究疾病的机制,如分子对接技术(配体受体)、虚拟病人。但新的技术也是基于已知的疾病机制,而选择合适动物模型是研究疾病机制的基石。