茜素红在食品硼酸检测中的应用研究

◎ 杨 军，熊 锐，黄 晶，陈 帜，梅 霞

(常德市食品检验所，湖南 常德 415000)

硼砂和硼酸具有增加食物韧性、脆度及改善食物保水性及保存度等功能[1]。硼砂经由食品摄取后，可与胃酸作用产生硼酸，硼酸不易被排出具有积存性，连续摄取后，会在体内蓄积，阻碍消化酵素作用，引起食欲减退、消化不良，抑制营养素的吸收，并产生呕吐、腹泻、红斑、循环系统障碍、休克及昏迷等症状[2]。虽然世界各国都早已禁止使用硼酸和硼砂用于食品添加，但是仍有非法添加现象存在，在面制品中使用尤为频繁。目前食品中硼砂或硼酸检测方法为分光光度法[3]，相关研究中还有甲亚胺分光光度法[4]、原子吸收分光光度法[5]、电感耦合等离子体光谱法[6]和液相色谱法等检测方法[7]。

姜黄素分光光度法是利用硫酸与姜黄混合生成的质子化姜黄与硼酸反应生成红色产物，溶液颜色的深浅与样品中硼酸含量成正比，通过比色可测定硼酸的含量；甲亚胺分光光度法主要利用甲亚胺的衍生物3-甲氧基-甲亚胺H作为硼显色剂。两种方法存在的主要问题有以下2点。①前处理费时且操作时间长，姜黄素法样品前处理涉及沉淀蛋白质、使用有机萃取等费时费力操作[3]；甲亚胺分光光度法样品前处理需要进行样品消解或者高温灰化[4]。②两种分光光度法会使用到三氯甲烷、浓硫酸等毒性较大试剂或较危险试剂，检测安全性上有隐患。此外，在环境检测领域常用有荧光光度法和原子吸收分光光度法测定硼元素，但是在食品中检测研究较少，且前处理涉及样品消解或高温灰化，也比较费时；原子吸收需要到特殊涂层的原子石墨炉，电感耦合等离子体光谱法和液相色谱法仪器成本高、检测成本高、不易于大规模推广。现有检测硼酸的荧光光度法使用水反应体系，食品类样品成分复杂，水提取溶液中会带来大量荧光干扰物质，产生无法消除影响，限制了食品类样品检测应用。因此开发出一种准确率高、样品前处理简单、检测时间短和检测成本低的硼酸检测方法对于食品安全监管具重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆干、挂面、面包、腊牛肉、酱板鸭和酱板鱼。

硼砂，分析纯，麦克林；硼酸标准贮备液（200 μg·mL-1），坛墨之间科技股份有限公司；正己烷，分析纯，国药集团；盐酸，GR，国药集团；氢氧化钠（9.6 g·L-1）。

茜素红溶液：分别用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水将茜素红配制成1.0×10-3mol·L-1，作为各反应体系显色剂；pH缓冲溶液：分别用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水将磷酸二氢钾和磷酸氢二钠分别溶解为6.0×10-2mol·L-1，临用前按体积比1∶1，作为各反应体系的pH缓冲溶液；硼酸标准工作液：分别用水、50%（V/V）甲醇水，50%（V/V）乙醇水将硼酸标准贮备液配制成 0 mg·L-1、0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-18个梯度，作为各反应体系的标准工作液。

1.2 仪器与设备

F97PRO荧光光度计，上海棱光技术有限公司；ML204T/02万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9246D电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乙醇做提取剂的样品前处理

称取粉碎烘干后的食品10 g于50 mL塑料离心管中，加入25 mL无水乙醇、500 μL浓盐酸，涡旋振荡5 min后，于5 000 r·min-1离心机中离心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料离心管中，加入9.6 g·L-1的氢氧化钠水溶液5 mL后摇匀，再加入2 mL正己烷，涡旋振荡30 s，于5 000 r·min-1离心机中离心3 min，去除上层正己烷层，下层清液为样品待测溶液。

1.3.2 甲醇做提取剂的样品前处理

称取粉碎烘干后的食品样品10 g于50 mL塑料离心管中，加入2.5 g氯化钠、40 mL甲醇，涡旋振荡5 min后，于5 000 r·min-1离心机中离心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料离心管中，加入5 mL纯水后摇匀，再加入4 mL正己烷，涡旋振荡30 s,于5 000 r·min-1离心机中离心3 min，去除上层正己烷层，下层清液为样品待测溶液。

1.3.3 显色及检测

分别移取2 mL标准系列溶液和样品待测溶液于10 mL塑料比色管中，依次加入pH缓冲溶液7 mL和茜素红溶液1 mL，摇匀后置于温度恒定处待溶液温度稳定后用1 cm石英比色皿在激发波长460 nm，发射波长598 nm处用显色后的0标校零，分别测量显色后的标品和样品溶液，用仪器自带工具拟合标准曲线，样品溶液荧光值在标准曲线上找出对应硼酸浓度，结合样品前处理的稀释倍数，可以计算出样品中硼酸的含量。

2 结果与分析

2.1 波长的选定

根据已有研究的反应条件，硼酸、茜素红与pH值为7.4的磷酸盐缓冲水溶液混合后，使用仪器自带三维波长扫描[8]。如图1和图2所示确实有比较明显的特征峰，且茜素红以及与硼酸和硼砂形成的形的络合物形成的特征峰重和，最大激发波长都在460 nm左右，发射波长都在598 nm左右。

图1 茜素红荧光三维扫描等高图

图2 硼酸茜素红荧光三维扫描等高图

2.2 茜素红浓度的确定

茜素红自带荧光特性且与形成的目标络合物特征峰重叠，因此尽量降低茜素红用量可以降低茜素红本底值的影响，在10 mL的显色反应中使用1.0×10-3mol·L-1茜素红溶液1 mL即可保证硼酸浓度在0.1～100.0 mg·L-1范围荧光值与浓度成正比，满足大多数情况下的检测需求。

2.3 缓冲溶液的选定

加入硼酸后，茜素红溶液在pH值为6.0～9.0的各缓冲溶液中，均能检测到比较明显的荧光增强，但是随缓冲溶液浓度增大，茜素红本底荧光值升高明显，也会导致在有机反应体系中导致盐溶液析出，经过择优选择6.0×10-2mol·L-1磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，临用前按体积比1∶1混匀后使用显色较为稳定。

2.4 不同反应体系对检测的影响

实验中发现在显色反应中加入有机溶剂后，能够提高硼酸或硼砂和茜素红形成的络合物的荧光强度，且体积比在50%左右时能达到最大增强效果，其中甲醇和乙醇都能形成较强增强作用，乙腈带来提升很少。根据图3不同反应体系三维波长扫描图所示，将所有溶液的溶剂换为体积比为50%有机水溶液形成的不同反应体系，可以显著提升络合物的荧光值，提高检测灵敏度。目前尝试的有机溶剂中，甲醇对荧光显色提升作用最大，比纯水反应体系提高约3.7倍，择优选择50%甲醇水作为该实验的反应溶剂。3种反应体系中，硼酸在0.1～100.0 mg·L-1浓度范围内均能保证荧光强度与硼浓度成正比，如图4所示拟合直线线性相关系数均在0.999以上。

图3 硼酸茜素红显色反应中加入不同溶剂后的荧光三维扫描图

图4 硼酸在不同反应体系中的标准曲线图

2.5 温度和时间对检测的影响

样品提取温度和显色反应温度对最终检测结果影响并不大，硼酸或硼砂与茜素红能够快速的形成的稳定的络合物，但是检测温度对荧光检测影响比较大。图5为10.0 mg·L-1硼酸显色后在不同温度下荧光强度，图6为10.0 mg·L-1硼酸显色后在不同时间段检测的荧光值，考虑到检测样品过程中可能会带来溶液温度的变化，在恒温条件将在显色后溶液置于恒温环境中反应10 min再检测，同时荧光光度计也置于相同恒温环境且提前预热恒温，如图6所示在90 min内可以保证检测荧光值稳定。

图5 温度对荧光检测强度影响图

图6 显色时间对荧光强度影响图

2.6 不同提取剂加标回收率检测

根据硼酸和硼砂的物理性质以及纯标品提取验证，水、甲醇、纯乙醇均可作为硼酸的提取剂；水和甲醇可以作为硼砂提取剂，而硼砂通过在乙醇中加入浓盐酸酸化后也可使用乙醇作为提取剂，但是使用含水溶剂进行样品提取，会出现无法消除的荧光本底，无法实现检测，因此样品在提取前都需要烘干水分以降低杂质本底。如果使用纯甲醇或纯乙醇提取，则能避免水溶性荧光杂质干扰，大大降低了本底值，甲醇提取过程中通过加入氯化钠可进一步降低杂质带来的本底。提取后的纯有机样品提取液，会带来脂溶性杂质，在50%甲醇水反应体系中会出现乳化现象，需要在显色前通过加入等体积水析出脂溶性杂质再通过正己烷去脂解决。

根据表1验证数据，通过对常用食品样品的进行低浓度液标及高浓度固标加标验证，使用甲醇或酸化后乙醇作为提取剂，样品加标浓度在20.0～800.0 mg·kg-1内都能保证比较好的添加回收率，因此该方法适合大部分种类样品的检测。

表1 不同提取剂的样品加标回收率表

3 结论

通过试验探究，发现硼酸与茜素红的荧光显色特性由于其高灵敏性及稳定性，可以用于食品中硼酸的检测。根据已有验证数据，将样品粉碎烘干后，通过甲醇+氯化钠或者这乙醇+盐酸的方式提取，再结合正己烷除脂得到的样品待测液，在50%甲醇-水反应体系中，可以快速准确的完成食品中硼酸后硼砂，样品前处理简单易行，所用试剂易得且相对安全，检测所需的荧光检测仪成本远低于液相色谱、原子吸收等大型仪器，适合大部分固体食品类样品的快速检测，利于推广运用。但是该方法暂时无法检测基质复杂的液体类食品，针对液体样品的前处理方法还需要进一步研究。