超高效液相色谱-串联质谱法测定腌鱼中氟虫腈及其代谢物的残留

◎ 杨 坤，刘桂琼，管春成，龙姜柳，顾 阳

（黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556012）

腌鱼是贵州省黔东南州侗族地区特色传统发酵型鱼产品，是稻田鲤鱼通过去除内脏、食盐腌制后，加入辣椒粉、醪糟、白酒等辅料混合均匀于坛子密封自然发酵3个月以上，制成一种风味独特、味道鲜美的民族特色食品[1-2]。因其有助消化和特有的酸辣甜风味等特点，具有很好的市场前景。

氟虫腈又名锐劲特，由法国罗纳-普朗克公司研发，其通过作用于昆虫γ-氨基丁酸受体，干扰昆虫的中枢神经引起昆虫神经和肌肉过度兴奋直至死亡，从而达到杀虫作用[3-4]。氟虫腈主要用于防治水稻、玉米及其他经济作物的虫害，被众多农药专家推荐为替代高毒有机磷农药的选择之一，成为防治虫害的新主力[5-7]。氟虫腈是一种化学结构不稳定的农药，使用后经光照、水解等作用会产生氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈等毒性极高的代谢产物[8]。氟虫腈虽已被国内外禁用，但近年来仍存在农药隐性添加而导致氟虫腈阳性检出的现象，欧洲16国等地更是爆出了大规模的氟虫腈污染鸡蛋的食品安全事件，造成恶劣的食品安全事故[9]。

目前，食品中氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有气相色谱-质谱法[10]、液相色谱法[11]和液相色谱-串联质谱法[12]，其前处理方法有QuEChERS法[13-14]和PRiME HLB法[15]，但这些文献主要以茶叶、水果蔬菜、猪肉为研究对象，没有专门针对有关鱼类产品中氟虫腈及其代谢物的分析。本文旨在研究不同的样品前处理方法对发酵腌鱼中氟虫腈及其代谢物的净化效果和基质效应的影响，建立一种高效简便的分析腌鱼中氟虫腈及代谢物的超高效液相色谱-串联质谱分析方法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLCMS/MS），以期为鱼类产品中氟虫腈及其代谢物的快速分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6批次腌鱼购置于凯里市，5批次购置于黎平县，4批次购置于锦屏县，4批次购置于从江县，3批次购置于榕江县。

氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈等4种农药标准溶液质量浓度均为100 mg·L-1，坛墨质检科技股份有限公司；甲醇，色谱纯，德国Merck公司；甲酸，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；乙酸铵，优级纯，国药化学试剂有限公司；氯化钠，优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司；无水硫酸镁，优级纯，国药化学试剂有限公司；C18，40～63 μm，安捷伦科技；N-丙基乙二胺（PSA）40～63 μm，安捷伦科技；试验用水为超纯水；PPRiME HLB固相萃取柱（6 mL，300 mg）。

1.2 仪器与设备

4000+型质谱联用系统，美国AB SCIEX公司；Agilent 1290型液相色谱仪，美国Agilent公司；Milli-Q型纯水机，美国Millipore公司；ML104型电子天平，梅特勒-托利多（上海）仪器公司；Multi Reax型多位试管振荡器，德国Heidolph公司；3-18k型高速冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的配制

（1）标准使用液的配制。吸取100 mg·L-1氟虫腈及其代谢物标准溶液1.00 mL于同一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，配制成10.00 mg·L-1混合标准储备液，该溶液可在4 ℃下避光保存3个月。使用前，吸取0.10 mL于100 mL容量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，配制质量浓度为10.0 ng·L-1的混合标准使用液，现配现用。

（2）基质匹配标准溶液的配制。移取5份空白样品净化溶液1.00 mL于5 mL离心管中。再分别加入混合标准使用液 25.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL和500.0 μL，氮吹至近干，加入流动相初始液1.00 mL溶解，配制成质量浓度为 0.25 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1和 5.00 ng·mL-1的基质匹配标准溶液系列，现配现用，过滤膜后待测。

1.3.2 样品处理方法

称取2.0 g（精确至0.01 g）腌鱼样品至50 mL离心管中加5 mL水涡旋混合5 min，再加入乙腈10.0 mL、4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，涡旋提取10 min，10 000 r·min-1冷冻离心5 min，吸取2.0 mL乙腈提取液于含有150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA和50 mg C18的净化管中涡旋净化1 min，静置后取1.00 mL上清液于5 mL离心管中氮吹至近干，加入流动相初始液1.00 mL溶解，过滤膜后待测。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；进样体积2 μL；流速0.30 mL·min-1；流动相A为含0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸铵溶液，B为含0.1%甲酸的甲醇溶液。洗脱程序：0～2.5 min，40%A；2.5～3.5 min，20%A；3.5～5.0 min，20%A；5.0～ 5.1 min，40%A，5.1～7.0 min，40%A。

（2）质谱条件。电喷雾负离子源（ESI-）模式；离子喷射电压-4 500 V；去溶剂温度550 ℃；气帘气压力138 kPa；碰撞气压力41 kPa；辅助气1压力414 kPa；辅助气2压力379 kPa；扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式，其他质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

氟虫腈与其代谢物的化学结构极为接近，酸度系数为-4.0～-6.0，且极性均偏弱[12]。查阅其他文献均选择BEH C18色谱柱作为分离柱[8-14]，本文分别对乙腈-水、乙腈-5 mmoL·L-1乙酸铵溶液、甲醇-水、甲醇-5 mmoL·L-1乙酸铵溶液、0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸铵溶液为流动相进行研究，当以0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸铵溶液作为流动相时，4种化合物具有较好的分离效果和灵敏度。因此，选择0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸铵溶液作为流动相。

2.2 质谱条件的优化

分别配制0.2 μg·mL-1的各化合物标准溶液，使用蠕动泵持续注入质谱仪对氟虫腈及其代谢物的质谱参数进行确认。氟虫腈及其代谢物中含有多种卤代基团，在负离子源上具有更高的强度[12]。因此，可对4种化合物进行负离子电喷雾母离子（Q1）扫描，确定其母离子，再进行二级质谱扫描（MS2），每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，并对质谱参数进行优化，优化后结果见表1。

表1 质谱参数表

2.3 前处理技术的优化

2.3.1 提取条件的选择

氟虫腈及其代谢物极性偏弱，在提取过程中易溶于乙腈溶液中，QuEChERS法自诞生以来主要研究应用于植物源性食品，成为农药残留检测的首选。因此，本试验主要以腌鱼为基质研究QuEChERS前处理净化优化。试验使用乙腈作为提取溶剂，比对不同盐析剂进行提取的效率。以含量为2.5 μg·kg-1的加标样品，分别按以下方法进行提取。方法1，加0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL提取。方法2，加乙腈溶液10 mL提取。方法3，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，5 g氯化钠盐析。方法4，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠盐析。其提取液直接上机测试，氟虫腈及其代谢物的回收率对比如图1所示。

由图1可知，方法4中4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠作为盐析剂的提取效果最佳，这是因为缓冲液更促进盐析脱水，使化合物分配更易从水相转移至有机相，从而提高溶剂的提取效率。

图1 不同提取方法氟虫腈及其代谢物的提取效率对比图

2.3.2 净化条件的选择

腌鱼是一类发酵后的水产品，除含有大量脂肪和蛋白质外，还含有少量辣椒素、色素等杂质。QuEChERS净化包主要有GCB、C18和PSA 3种吸附剂，文献[3]已验证GCB易吸附4种农药，50 mg C18+50 mg PSA组合在禽蛋和蛋制品上具有较好的净化效果。因此，本试验在其基础上考察了PRiME HLB、QuEChERS和PRiME HLB结合QuEChERS等方式在腌鱼基质中的净化效果，各取2 mL提取液于PRiME HLB柱、QuEChERS净化包和PRiME HLB结合QuEChERS净化包中净化，接收1.00 mL净化液后氮吹近干并用流动相初始液复溶至1.00 mL，过0.22 μm滤膜上机。从图2可知，PRiME HLB净化4种目标化合物的回收率为74.76%～92.94%，PRiME HLB结合QuEChERS净化4种目标化合物的回收率81.45%～113.69%，QuEChERS净化除了氟虫腈亚砜回收率为83.27%外，其他3种目标化合物回收率在86.05%～98.65%，回收效果满意。因此，本研究采用QuEChERS净化法对腌鱼样品进行前处理。

图2 不同净化条件氟虫腈及其代谢物的回收率比对图

2.4 标准曲线、检出限与定量限

在仪器工作条件下对基质匹配标准溶液系列进行测定，以质量浓度为横坐标，以其相对应的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，在0.25～10.00 ng·mL-1呈良好的线性关系，相关系数均＞0.999；在1.0 ～ 10.0 μg·kg-1，氟虫腈及其代谢物的回收率为91.79%～109.84%，相对标准偏差为0.91%～3.39%（n=6）；以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比计算检出限和定量限，方法检出限和定量限分别为0.2～0.4 μg·kg-1和 0.8 ～ 1.2 μg·kg-1，结果见表3。

表3 线性参数、检出限和定量限表

2.5 精密度和回收试验

在 腌 鱼 基 质 空 白 样 品 中 分 别 按 1.0 μg·kg-1、3.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13 水平进行加标试验，每个添加水平重复测定6次来测定回收率，结果见表4。结果表明，3个添加水平下腌鱼样品中氟虫腈及其代谢物的平均回收率为91.79%～109.84%，相对标准偏差为0.91%～3.39%。说明该方法符合腌鱼中氟虫腈及其代谢物残留检测的检验方法要求。

表4 精密度和回收试验结果表（n=6）

2.6 样品分析

按照试验方法对22批次腌鱼进行检测，除了1批次腌鱼样品检出氟虫腈砜阳性离子且低于检出限外，其他腌鱼均未检出。

3 结论

本文系统地研究了3种不同的样品前处理方法对发酵腌鱼中氟虫腈及其代谢物的净化效果和基质效应影响，建立了UPLC-MS/MS同时测定腌鱼中氟虫腈及其代谢物残留的分析方法。结果表明该方法简便、灵敏，各检测指标均满足分析检测的要求，且适用于腌鱼中氟虫腈及其代谢物残留的快速定性、定量分析。