当归多糖对妊娠期易栓症大鼠的抗炎作用及对凝血功能的影响

麻卲㛃，李晓茹，吕志华，吴纪珍

（1.郑州市第一人民医院妇科，河南郑州 450000；2.河南省人民医院危重症医学科，河南郑州 450000）

易栓症是指由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等的遗传性或获得性缺陷者存在获得性危险而容易发生血栓栓塞的疾病或状态，主要临床表现为血栓形成，血栓类型以静脉血栓为主[1]。妊娠期妇女血容量增加，血流动力学改变，易发生静脉血栓，同时凝血因子增加，纤溶活性降低，处于获得性易栓状态，导致易栓症发病率较高，并增加妊娠并发症，影响妊娠结局。目前，临床对妊娠易栓症的治疗尚无统一定论，主要通过抗凝、抗血小板及溶栓等方法治疗。因此，寻找安全、有效的治疗途径，对于改善妊娠期高凝状态具有重要意义。当归多糖是当归的主要成分，具有改善血液系统、促进免疫、抗肿瘤、抗辐射的作用[2-3]。当归多糖不仅影响动物机体的造血系统，而且具有双向调节凝血的功效[4]。研究发现，当归多糖主要影响内源性凝血系统，延长凝血酶活时间，产生抗凝血作用，同时，促进血小板聚集，发挥止血功能[5]。但是，目前当归多糖在治疗妊娠期易栓症中发挥的作用尚不完全明确，因此，本研究拟通过建立妊娠期易栓症大鼠模型，观察当归多糖对大鼠妊娠期易栓症的抗炎作用及对凝血功能的影响，以期为临床治疗奠定基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级6周龄大鼠120只，雌性85只，雄性35只，体质量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，动物生产许可号：SCXK（沪）2019-0002。购买后饲养于河南省中医药研究院，使用许可证号：SYXK（豫）2019-0001，饲养于温度23～25℃，湿度60%～65%环境中，昼夜12 h交替适应性饲养。

1.2 药物、试剂与仪器当归多糖（北京索莱宝科技有限公司，批号：SA8740）。脂多糖（LPS）（美国Sigma-Aldrich公司）；白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、基质细胞衍生因子1（SDF-1）、血浆D-二聚体（D-D）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、组织因子（TF）、纤维蛋白原（FIB）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海晶抗生物公司）。ST-360酶标仪（科华生物公司）。

1.3 建模雌性大鼠随机留取15只为正常组。将发情期的70只雌性大鼠与雄性大鼠合笼（2∶1），以发现阴道栓记为妊娠0 d。妊娠7 d，将63只怀孕雌性大鼠用3%戊巴比妥钠按照30 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾静脉注射30 mg/kg的LPS，诱导大鼠产生易栓症[6]。若应用多普勒超声监测血流有血栓形成，则判断为建模成功[7]。其中，死亡大鼠7只，流产大鼠7只，易栓症大鼠49只。

1.4 分组与干预将建模成功的49只雌性大鼠随机分为模型组13只，当归多糖低、中和高剂量组各12只。自建模成功后24 h开始，参照文献剂量[8]，当归多糖低、中和高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kg当归多糖，1次/d，连续7 d，模型组灌胃等体积生理盐水，干预频次同上。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 测量出血、凝血时间末次给药30 min后，用断尾法[9]测定出血时间。固定大鼠后，将其尾部固定并垂直，从大鼠尾部3 mm处剪断，使血液自行流出，每10 s用滤纸吸1次尾部血液，直至血液吸不出为止，记录断尾至出血停止时间。

末次给药30 min后，用玻片法[10]测定凝血时间。将5号注射针头通过眼眶刺入大鼠眼球后静脉丛，使血液自行流出，用滤纸吸去第1滴血，而后将血液滴在清洁的玻片上，使血液直径在5～10 mm，每15 s用清洁干燥的针头由血液边缘向内挑动1次，直至能挑起纤维蛋白丝为止，记录血滴到玻片到能挑起纤维蛋白丝的时间。

1.5.2 ELISA法检测血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平麻醉大鼠，腹腔静脉取血以4 000 r/min（离心半径8 cm）离心10 min后，分别提取血清和血浆（留待下一步检测）于-20℃保存。取血清用ELISA试剂盒测定IL-6、TNF-α、SDF-1水平。按照ELISA试剂盒说明书加样，用全自动酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（OD）值，通过绘制标准曲线计算得出IL-6、TNF-α和SDF-1浓度。

1.5.3 ELISA法检测血浆TF、AT-Ⅲ、D-D、FIB水平取保存于-20℃的血浆，按照ELISA试剂盒说明书加样，用全自动酶标仪测定450 nm波长处的OD值，通过绘制标准曲线计算得出TF、AT-Ⅲ、D-D、FIB浓度。

1.5.4 HE染色法观察大鼠含血栓静脉管壁病理变化处死大鼠，打开腹腔，解剖左肾静脉以下下腔静脉至左右髂总静脉汇合处，切取下腔静脉及其内部血栓。10%甲醛固定36 h，流水冲洗，9%硝酸脱钙，闭光过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜观察。

1.6 统计方法采用SPSS 24.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠出血、凝血时间比较表1结果显示：与正常组比较，模型组出血时间增加，凝血时间减少（P＜0.05）；与模型组比较，当归多糖低、中、高剂量组出血时间减少，凝血时间增加（P＜0.05）；与当归多糖低剂量组比较，当归多糖中、高剂量组出血时间减少，凝血时间增加（P＜0.05）；与当归多糖中剂量组比较，当归多糖高剂量组出血时间减少，凝血时间增加（P＜0.05）。

表1 各组大鼠出血、凝血时间比较Table1 Comparison of bleeding and coagulation time between various groups of rats （±s）

表1 各组大鼠出血、凝血时间比较Table1 Comparison of bleeding and coagulation time between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与当归多糖低剂量组比较；④P＜0.05，与当归多糖中剂量组比较

凝血时间/s 246.13±24.97 99.46±10.25①126.79±12.89①②175.03±18.51①②③210.31±21.64①②③④29.527＜0.001组别正常组模型组当归多糖低剂量组当归多糖中剂量组当归多糖高剂量组F值P值鼠数/只15 13 12 12 12出血时间/s 89.58±9.84 267.02±26.87①223.96±23.68①②183.87±18.61①②③134.05±14.42①②③④43.138＜0.001

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比较表2结果显示：与正常组比较，模型组IL-6、TNF-α、SDF-1水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，当归多糖低、中、高剂量组IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）；与当归多糖低剂量组比较，当归多糖中、高剂量组IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）；与当归多糖中剂量组比较，当归多糖高剂量组IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比较Table 2 Comparison of levels of serum IL-6，TNF-αand SDF-1 between various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比较Table 2 Comparison of levels of serum IL-6，TNF-αand SDF-1 between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与当归多糖低剂量组比较；④P＜0.05，与当归多糖中剂量组比较

SDF-1/（μg·mL-1）236.31±25.27 438.37±42.89①378.54±38.03①②325.41±32.98①②③279.58±28.03①②③④34.648＜0.001组别正常组模型组当归多糖低剂量组当归多糖中剂量组当归多糖高剂量组F值P值鼠数/只15 13 12 12 12 IL-6/（μg·mL-1）121.62±12.53 319.18±27.59①276.38±28.10①②231.46±23.74①②③186.74±19.02①②③④41.257＜0.001 TNF-α/（μg·mL-1）206.62±21.03 398.91±40.31①337.52±34.21①②283.67±29.32①②③241.68±24.96①②③④39.523＜0.001

2.3 各组大鼠血浆TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比较表3结果显示：与正常组比较，模型组血浆TF、D-D、FIB水平升高，AT-Ⅲ水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，当归多糖低、中、高剂量组血浆TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）；与当归多糖低剂量组比较，当归多糖中、高剂量组血浆TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）；与当归多糖中剂量组比较，当归多糖高剂量组血浆TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血浆TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比较Table 3 Comparison of plasma TF，D-D，AT-Ⅲ，FIB levels between various groups of rats （±s）

表3 各组大鼠血浆TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比较Table 3 Comparison of plasma TF，D-D，AT-Ⅲ，FIB levels between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与当归多糖低剂量组比较；④P＜0.05，与当归多糖中剂量组比较

FIB/（μg·L-1）267.65±27.53 385.75±39.16①352.53±36.17①②327.67±33.64①②③287.63±29.17①②③④30.283＜0.001组别正常组模型组当归多糖低剂量组当归多糖中剂量组当归多糖高剂量组F值P值鼠数/只15 13 12 12 12 TF/（μg·mL-1）143.58±14.54 298.97±30.05①266.26±27.12①②223.46±23.17①②③185.67±19.12①②③④32.734＜0.001 D-D/（μg·mL-1）169.31±17.13 326.53±33.21①276.57±27.96①②238.63±24.45①②③197.67±20.03①②③④31.468＜0.001 AT-Ⅲ/（μg·mL-1）246.68±25.14 89.65±9.15①120.57±12.26①②168.53±17.65①②③197.89±20.26①②③④25.432＜0.001

2.4 各组大鼠含血栓静脉管壁病理变化比较图1结果显示：正常组血管内壁正常，无炎性细胞浸润；模型组血管内壁增生，大量钙盐及含铁血黄素析出，新生毛细血管数量增多，血栓形成；当归多糖低剂量组血栓减少，血小板小梁增多聚集成堆，少许纤维素样成分析出；当归多糖中剂量组血管壁边缘少许白色血栓形成；当归多糖高剂量组仅有微量血小板血栓形成。

图1 各组大鼠含血栓静脉管壁病理变化比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of pathological changes of vein wall with thrombus in various groups of rats（by HE staining，×100）

3 讨论

当血管内皮细胞受损，诱导内皮细胞中TF表达，TF启动外凝血途径，促进内凝血途径活化，引起易栓症形成[11]。随着医学界研究的深入，专家们希望通过改变某一节点，使机体恢复稳态，以改善高凝状态，预防血栓形成[12]。当归具有广泛的药理作用，在神经系统、免疫系统和循环系统等方面研究比较深入，但其在抗炎、抗血栓形成等方面尤其是对免疫炎性易栓症的抑炎作用研究较少[13]。当归多糖是当归的主要成分之一，本研究主要探究当归多糖对妊娠期易栓症大鼠的抗炎作用及对凝血功能的影响。

当归多糖具有明显的抗炎作用。体外实验研究显示，当归多糖可通过抑制炎症反应，减轻神经元细胞炎性损伤[14]；动物实验研究表明，其可显著降低IL-6、TNF-α等促炎因子水平，对关节炎大鼠具有明显的治疗作用[15]。本研究结果显示：当归多糖各剂量组大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平明显低于模型组，提示当归多糖具有抗易栓症炎症作用。当归是常用活血补血中药，当归多糖作为其主要的活性成分，可通过增强血红蛋白和红细胞等血液学参数，对贫血白化大鼠具有明显的造血作用[16]，提示其在血液循环中具有重要作用。血栓发展始终伴随着炎症反应，两者之间存在相互促进作用。IL-6、TNF-α等炎性介质可促进机体高凝状态，导致血栓形成；同时，血栓形成过程中，凝血酶及相关因子可进一步诱导炎症反应。TF参与凝血过程，与静脉血栓形成密切相关；D-D水平变化与体内高凝状态和纤溶亢进有关，其水平升高表明血栓形成和纤溶发生；FIB可促使红细胞聚集，是影响血浆黏度的重要因素；AT-Ⅲ是重要的抗凝因子，在保持体内凝血和纤溶平衡中发挥了重要作用。本研究结果显示，当归多糖治疗组较模型组血浆TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高，且含血栓静脉管壁病理变化较模型组明显减轻，提示当归多糖对易栓症具有抗血栓作用。

当归多糖是当归中促进造血的有效成分，在外周血细胞减少和骨髓受到抑制时，能增加外周血红细胞、白细胞、血红蛋白及骨髓有核细胞数，促进生血[17-18]。当归多糖不仅具有造血功能，而且具有双向调节凝血的功能，通过影响内源性凝血系统，延长凝血酶活化时间，产生抗凝血作用，同时，促进血小板聚集，发挥止血功能。已有研究证实，当归多糖具有活血祛瘀功能，可调节血瘀证大鼠凝血功能和血液流变学指标，改善血管内皮损伤[19]。另有研究发现，当归多糖及其硫酸酯能够显著延长凝血时间，缩短出血时间，具有较强的抗凝血和止血作用[20]。本研究得到相似结果，当归多糖治疗组出血时间减少，凝血时间增加，提示当归多糖对易栓症具有抗凝血作用。

综上所述，当归多糖在大鼠妊娠期易栓症中发挥抗炎作用，且具有抗凝血、抗血栓功效，可为临床治疗妊娠期易栓症提供理论依据。