酶底物法测定中山城市供水中的肠球菌

冯飞燕，于晓君，龚 晋，吴佳萍

（中山公用水质检测有限公司，广东中山 528403）

肠球菌是新国标《生活饮用水卫生标准》 （GB 5749—2022）附录A 参考指标。新国标删除了耐热大肠菌指标，改用埃希氏大肠菌作为粪性污染的指示菌，研究表明肠球菌也是一种优于总大肠菌的粪便污染指示物。

在细菌学分类上，肠球菌（Enterococcus）属原归属于链球菌属。肠球菌易污染食品以及生活和加工用水，易传播疾病。此外，肠球菌具有天然耐药和获得性耐药的特征，会使所致感染治疗困难[1]。因此，肠球菌成为食品、水质、加工设备卫生和生产环境卫生状况的评估指标。肠球菌的重要特点是在水中存活的时间比大肠杆菌长，对于氯的抵抗力更强。肠球菌可用于输配水系统维修后或新管线铺设后的水质检测[2]。卫生学家认为加强原水中肠球菌的检测有一定意义，在水厂出厂水及管网水的检测中增加对肠球菌的监测，能进一步保障城市供水安全。

肠球菌的标准检测方法通常有两种，滤膜法[3]和酶底物法[4]，通过两种方法对比，季婉菁[5]的结论是两种方法均可对饮用水中肠球菌进行检测，而采用酶底物法更简便。褚福敏[6]发现酶底物法能大大降低假阳性和浑浊度、非肠球菌的干扰，更加准确可靠。山东省地方标准[7]用酶底物法测定饮用水和水源水的肠球菌，辽宁省地方标准[8]用酶底物法测定地表水、地下水、饮用水、海水和工业废水中的肠球菌。本文采用酶底物法验证其正确度和精密度，并应用于检测原水、出厂水、管网水、二次供水，龙头水，新管道水，老旧小区管网改造水，对肠球菌在供水全流程中进行风险识别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Enterolert肠球菌试剂，97孔定量盘，无菌采样瓶：100 mL，封口机；恒温培养箱：（41.0±0.5）℃；紫外灯：6 W，365 nm。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

肠球菌利用特异性代谢产物β-葡萄糖苷酶分解培养基中的荧光指示剂4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，释放出荧光产物，使样品在紫外光照射(41.0±0.5)℃，（24±2）h 下产生特征性荧光，以此来检测样品中的肠球菌。酶底物法所用试剂包中添加的成分可抑制高达200×104个/100 mL的异样微生物，能避免非肠球细菌（如沙雷菌属、克雷伯菌属和绿色气球菌属）干扰而导致的测定结果误差，Enterolert 固定底物酶底物营养指示剂检测肠球菌，提高检测的准确度。

1.2.2 样品采集

检测水样来自中山西江流域磨刀门水道、小榄水道、鸡鸭水道3 个水道7 个水源地，从北到南分别是磨刀门水道的GZ、QL，NL，小榄水道的DF、DS、D，鸡鸭水道的N，还有3 个水库水，分别是CJ、NT、LT。采样频率为每周1 次，连续3 周。

城市供水选取了城区主要3 个出厂水，样品编号为CDF、CQL、CCJ，5 个管网水，样品编号为G1 ～G5，5 个二次供水，样品编号为E1 ～E5， 5 个龙头水，样品编号为L1 ～L5，4 个新管道水，样品编号为X1 ～X4，3 个老旧小区管网改造水，样品编号为J1 ～J3。

1.2.3 试验步骤

①将100 mL 水样倒入无菌采样瓶中。②将一份EnterolertTM 测试包倒入装有100 mL 水样的无菌采样瓶中。盖上盖子，摇匀，至完全溶解。③将瓶中水样全部倒入97 孔定量盘中，用封口机封口。④将已封口的定量盘放在（41.0±0.5）℃培养箱中培养 （24±2）h。⑤培养24 h 后，取出定量盒，在暗室中使用6 W，365 nm 的紫外灯在距样品15 cm 的位置处观测是否显示蓝色荧光。显示为蓝色荧光的为肠球菌阳性，无荧光的为肠球菌阴性。计数阳性个数对照MPN 表得到定量检测结果。

2 结果与分析

2.1 方法的正确度

采用上述方法测定质控样，结果如表1。从阴阳性控制看，酶底物EnterolertTM 对大肠杆菌（阴性对照）与肠球菌（阳性标样）反应合格。粪肠球菌质 控 真 值 为（1 813±332）MPN/100 mL，log 值 为（3.26±0.70），可 接 受 范 围 为881 ～4 097 MPN/ 100 mL，两次质控结果在可接受范围内。两次质控平均值为950.1 MPN/100 mL，log 值为2.98，相对误差为8.6%，平行双样的重复性r=0.03，满足食品微生物实验室内平行双样重复性的要求r≤0.25[9]。

表1 酶底物法测定质控样结果

2.2 方法的精密度

根据食品微生物实验室7 和ISO 4833-1：2013[10]质控规定，使用相同方法，在同一实验室检测同一种物质，由同一操作者使用同一设备在短时间内的两次独立的单次试验结果的绝对差值，不应大于重复性限r=0.25，以10 为底的每毫升中微生物计数的对数。表2 用实际水样验证方法的精密度，从重复性r判断方法精密度（r=log10平行1－log10平行2），计数＞10 MPN/100 mL 的样品平行双样r可达到质控要求，计数＜10 MPN/100 mL 的样品难以达到质控要求。

2.3 地表水肠球菌的测定结果

选取中山市部分地表水，包括西江3 条水道7个供水水源地，3 个水库水，利用酶底物法测定以上10 个地表水肠球菌，结果见表2。结果表明，西江源水肠球菌远比水库水高，中山用于供水水源的水库迁移了村民，禁止工农业生产，因此受到粪便污染少；DS 源水肠球菌比其他水源地高很多，此水源地在中山供水规划中将被取缔。

表2 实际水样测定肠球菌的精密度

粪（耐热）大肠菌群（Thermotolerant coliforms）和肠球菌（Enterococcus）都是判断污染来源的粪便污染指示物。表3 对比了中山市以上10 个地表水粪大肠菌群和肠球菌，当样品检测出粪大肠菌为阳性时，肠球菌也为阳性，定量结果肠球菌比粪大肠菌群小，这跟褚福敏[6]报道一致。粪大肠菌群是《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）唯一粪便污染指示菌。日益进步的微生物学、流行病学及统计学方法进一步证实，肠球菌是优于总大肠菌群和粪大肠菌群的粪便污染指示物[5]。我国2022 年3 月新发布的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2022）采用更有卫生意义的指示菌——埃希氏大肠菌，删除了耐热大肠菌群，在附录A 的参考指标中仍然保留肠球菌。

表3 中山市部分地表水粪性大肠菌和肠球菌对比

2.4 城市供水肠球菌的测定

城市供水选取了城区主要3 个出厂水CDF、CQL、CCJ，5 个管网水G1 ～G5，5 个二供泵 房E1 ～E5，5 个 龙 头 水L1 ～L5，4 个 新 管 道 水X1 ～X4，3 个老旧小区管网改造水J1 ～J3。测定以上25 个水样的余氯、总大肠菌群、肠球菌，结果见表4。当饮用水中有余氯存在下或经过余氯消毒，全流程节点总大肠菌和肠球菌都未检出。

表4 城市供水全流程测定余氯、总大肠菌群、肠球菌

3 结论

本文验证酶底物法测定水中肠球菌方法，对中山市有代表性的10 个水源地，25 个城市供水用酶底物法测定肠球菌，结论如下。

（1）酶底物法测定水中肠球菌质控平均值 950.1 MPN/100 mL，在可接受范围881 ～4 907 MPN/ 100 mL。实际水样测定肠球菌验证方法精密度，得到测定值＞10 MPN/100 mL 的水样，实验室内重复性r≤0.25，满足微生物质控要求。因此，酶底物法测定水中肠球菌方法准确、可靠。

（2）用酶底物法测定中山市地表水的10 个水源地样品中的肠球菌，结果发现西江水比水库肠球菌高。肠球菌与粪大肠菌定性一致，定量更小。

（3）用酶底物法测定中山城市供水全流程出厂水、管网水、二次供水、龙头水、新管道水和老旧小区管网改造水的肠球菌，结果发现在有余氯存在下或经过余氯消毒，城市供水均未检出，因此正常供水状态下，肠球菌的风险主要在于源头，城市供水其他环节的肠球菌风险低。