硼中子俘获治疗的理论基础及其在乳腺癌中的相关 研究*

何晓梁，瞿凡，赖芋州，刘嫱霖，田超

646000 四川 泸州，西南医科大学 临床医学院（何晓梁、瞿凡、田超）；611731 成都，电子科技大学 临床医学院（赖芋州）；601132 成都，成都中医药大学 临床医学院（刘嫱霖）

20世纪30年代，有研究者就提出了硼中子俘获治疗（boron neutron capture therapy，BNCT）来治疗癌症的观点，它可以选择性地破坏癌细胞，同时保留正常组织。作为一种潜在有用的癌症治疗工具，BNCT在多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、复发性头颈癌、皮肤黑色素瘤等治疗中表现出极大优势。基于此，有研究者将BNCT用于乳腺癌的治疗中。相较于单一放疗，硼药靶向癌细胞再通过放疗极大降低了放疗过程中的能量损失以及患者副反应，实现更加精准的治疗。本文将围绕BNCT在乳腺癌中的应用首次作重点阐述，以此来探讨乳腺癌新的治疗方向。

1 BNCT的原理及发展状况

BNCT是一种结合中子辐照和靶向药物的二元放射治疗方式。中子源装置是完成BNCT的重要组成部分。它的基本原理是利用热中子与非放射性的10B发生中子俘获反应，释放出两个高传能线密度的粒子—α粒子（约150 keV/μm）和7Li粒子（175 keV/μm），这些粒子在组织中的射程与细胞直径相似，约为5 ～ 9μm。在热中子照射情况下，α和7Li粒子的杀伤作用仅限于摄取10B药物的细胞及其紧邻细胞，对周围正常组织的辐射损伤较小［1］。BNCT目前在中枢神经系统肿瘤如脑胶质瘤［2-3］、头颈部恶性肿瘤［4］以及恶性黑色素瘤［5-6］治疗中都取得了令人欣喜的结果。早在1936年，有研究者就提出了在癌症治疗中使用中子俘获反应的想法［7］，1940年Kruger首次报道了BNCT的体外肿瘤实验，1951年美国麻省总医院开展了第1例BNCT临床实验。1989年Mishima等［8］第一次将BNCT应用于人浅表组织的黑色素瘤治疗。BNCT的基础研究和临床研究主要集中在日本和欧美。日本在2020年3月批准了BNCT用于治疗不能手术切除的或者局部复发性头颈癌，标志着BNCT正式成为临床上治疗肿瘤的手段之一［9］。当前，BNCT正处在高速发展的窗口期。我国在BNCT的研究上也投入了大量人力、物力并取得了显著进步。2018年，中科院高能所在广东东莞建成了我国首台散裂中子源；2019年12月，BNCT实验装置首次打靶成功获得中子束流；2020年国内首座BNCT治疗中心在广东东莞落成。厦门弘爱医院也已落成全球单体最大的加速器型BNCT肿瘤治疗中心。这将进一步推动BNCT成为肿瘤一线治疗手段的步伐。

2 中子源

中子源装置一直是阻碍BNCT发展的重要因素之一［10］。目前可用于BNCT治疗肿瘤的中子源主要有反应堆中子源和基于加速器的中子源两种。绝大多数基础及临床研究均选择能够提供足够中子通量的核反应堆作为中子来源。截止到2019年底，全球仍然活跃的BNCT反应堆包括日本KURR、中国台湾THOR、阿根廷RA-6、北京IHNI及波兰MARIA反应堆 ，其中KURR与THOR均已到运行年限而停运。考虑到核反应堆造价高以及安全性等因素，反应堆BNCT设施将逐步退出舞台。BNCT所用中子源需满足两个条件: 射束开口的中子通量必须大于109n·cm-2·s-1；中子必须有足够高的能量以穿透肿瘤组织。近年来，加速器驱动中子源的发展开启了BNCT技术蓬勃发展的新局面。用于BNCT治疗的加速器主要有回旋加速器、电磁直线加速器、静电直线加速器三种。这种中子源利用质子加速器出射的质子和低原子序数物质反应得到中子。其安装简便、运行维护成本低、占地面积小、安全稳定，适合医院应用。目前，日本、中国、芬兰、美国、俄罗斯等国都在积极推进加速器硼中子治疗（accelerated based BNCT， AB-BNCT） 装置的研究与建设［11-12］。TAE生命科学（Foothill Ranch，CA，USA）正在开发他们自己的小型加速器，更方便BNCT的实施。俄罗斯计划与布德科尔核物理研究所合作建造了一种新型的粒子加速器 —— 真空绝缘的串联加速器。同时，在日本和芬兰，基于AB-BNCT的临床试验也正在积极开展中［13-14］，如果临床试验成功，BNCT无疑将在临床应用和发展方面展现出巨大前景。

3 硼递送剂

硼递送剂能否被肿瘤特异摄取直接决定了BNCT的治疗效果。20世纪50年代，硼酸及其衍生物首次应用于临床试验，但这些是基本的化合物，不仅缺乏肿瘤靶向性，还有一定的生物毒性，导致人体产生急性放射副反应，最终以失败告终。1968年，日本神经外科医师畠中坦教授使用硫基十二硼烷二纳盐（sodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate ，BSH）药物进行了日本首例 BNCT临床治疗研究［15］。1987年，日本神户大学的三岛豊教授首次使用（L）-4-二羟基硼基苯丙氨酸（L-boronophenylalanine，BPA）进行皮肤黑色素瘤的BNCT临床试验［16］，开启了BPA靶向药品在 BNCT上的应用。目前被FDA批准用于临床研究的 BNCT药物仅有BSH和BPA，其中BPA于2020年3月在日本获批上市，这是全球首个获批上市的BNCT临床药物。硼递送剂须满足：（1）与肿瘤细胞结合特异性高；（2）每个肿瘤细胞内至少聚集109个10B原子或每克肿瘤组织中至少含20μg10B原子；（3）对正常组织无毒性，且在正常组织及血液中快速代谢而在肿瘤细胞滞留较长时间；（4）肿瘤组织与正常组织硼浓度比值 ＞ 3～4∶1。在肿瘤周围的正常组织细胞中的氢和氮也可发生中子俘获反应，只有当肿瘤组织硼浓度显著高于正常组织，才能在最大限度杀死肿瘤细胞的同时，尽可能降低对周围正常组织损伤。即使当前新型硼携带剂包括卟啉类、氨基酸类、核苷酸类、树枝状大分子硼携带剂、单克隆抗体类硼携带剂、脂质体、纳米微粒等都不能完全符合上述条件。

为了更好地将10B送到肿瘤细胞中，还需研制更新的硼药运载工具和保护措施，比如给含硼多肽镀一层膜，利用脂质体把大量的10B包裹起来防止它在被吸收前发生水解；为了增加亲肿瘤效果，给硼药分子嫁接上靶向特定肿瘤受体的配体如上皮生长因子受体［17］和叶酸受体以及利用仙台病毒的外壳来包裹硼-10等。在给药方式上研究者们也在逐步摸索，Capuani等［18-19］研究在体外C6胶质瘤细胞或体内动物模型肿瘤中使用L-DOPA预处理后，可显著提高肿瘤细胞中的硼含量，Barth等［20-21］研究设计经颈动脉灌注高渗性甘露醇溶液以暂时渗透性开放血-脑脊液屏障以提高神经系统肿瘤细胞中的硼含量。但这些研究尚未进入临床阶段，目前只有BPA和BSH可以在临床中使用。研发将足量的硼递送到肿瘤细胞并能长期滞留的新型硼药仍是BNCT技术发展与疗效提升的一个热点问题。

4 BNCT在乳腺癌中的相关研究

根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布2020年全球最新癌症负担数据显示，乳腺癌发病率已经超过肺癌，位居首位［22］。当前BNCT在乳腺癌中的研究仍主要集中在高效硼递送剂的研发，围绕BPA、BSH优化给药模式和给药方式［23］。

4.1 纳米材料作为硼递送剂的研发

纳米结构化合物因其光学，机械和化学特征以及操纵和调节复杂生物过程的可能性而脱颖而 出［24］。 Li等［25］验证了氮化硼纳米颗粒（boron nitride nanoparticles ，BNNPs）在三阴性乳腺癌治疗中的有效性。BNNP 被一种相变溶菌酶（phase-transitioned lysozyme，PTL）包裹形成PTL@BNNP，可保护BNNP在血液循环过程中不被水解，富集在三阴性乳腺癌细胞胞质中，俘获治疗后可通过维生素C触发降解，同时螯合放射性同位素离子用于PET成像。包被的BNNP在保持良好的肿瘤与非肿瘤比率的同时显示出较高的肿瘤硼累积。经小鼠尾静脉注射PTL@BNNPs后24小时肿瘤摄取量为6.18%±2.18% ID/g。含硼量在肿瘤与血液、肿瘤与肌肉和肿瘤与脂肪的比率分别高达2.71±0.96、8.32±1.07 和 5.96±0.37，这至少与BPA、BSH的比率相等，甚至更好。作为一种纳米级含硼药物，PTL@BNNPs 有效改善了小分子含硼药物硼含量低、靶向性差的不足。同时，体内实验表明，携带4T1细胞的小鼠注射PTL@BNNPs后24小时经中子照射后显示，与空白组相比，肿瘤生长至少延迟10天，照射后第21天PTL@ BNNPs小鼠的肿瘤体积（325±71）mm3远低于空白组 （1485±205）mm3，PTL@BNNPs+中子组小鼠存活时间比其它组（包括空白组、仅PTL@BNNPs组和仅中子照射组）延长。对小鼠解剖后的主要器官进行苏木精-伊红染色（H&E）也未显示出明显组织学异常。该策略不仅利用BNNP的高硼含量抑制杀死肿瘤细胞，还成功地对BNNP进行了按需降解，避免了纳米颗粒长期累积造成的潜在毒性，有望成为BNCT治疗的有效载体。

纳米级共价有机聚合物也具有高效硼载荷能力。Shi等［26］制备了一种新型碳硼烷负载纳米共价有机聚合物（carborane-loaded nanoscale covalent organic polymers，BCOPs）。通过改进得到BCOP-5T经1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-［氨基（聚乙二醇）］（DSPE-PEG）功能化形成稳定的水相纳米颗粒。在加入中子辐照后，4T1乳腺癌荷瘤小鼠表现出显著的肿瘤抑制作用。同时未观察到明显的物理组织损伤和异常行为，表明硼输送是成功的，并且具有肿瘤选择性。通过调整给药频率，可有效改善肿瘤细胞对硼的摄取，试验得出三次单独注射的肿瘤硼浓度为（84.93±2.68）ppm明显高于单次注射（55.24±2.13）ppm，三次单独注射的肿瘤与肌肉、肿瘤与血液的比率分别为25.20±3.41、7.46±0.66明显优于单次注射瘤肌比1.46±0.76和瘤血比0.81±0.44。经DSPE-BCOP-5T输注和中子辐射后的肿瘤生长率低于其他组，存活时间显著延长。经H&E染色分析试验器官没有明显的病理损伤或变化。这表明DSPE-BCOP-5T可以作为一种有前途的疏水性药物载体。Heide等［27］介绍了一种名为右手螺旋线圈纳米管的非传统药物递送装置，可以有效摄取o-碳硼烷C2B10H12，并将其输送到肿瘤细胞中用于BNCT。但目前尚未有在乳腺癌中的相关研究。

4.2 脂质体作为硼递送剂的研发

脂质体作为硼运载工具通过增强渗透性和滞留效应在大多数肿瘤中被动累积。Kueffer等［28-29］使用富含硼的脂质体作为递送系统，提供两种硼簇化合物，K［nido-7-CH3（CH2）15-7，8-C2B9H11］（MAC）和 Na3［1-（2’-B10H9）-2-NH3B10H8］（TAC）。它们携带高硼有效载荷，还具有高水溶性和极低的毒性。在给患有EMT6乳腺肿瘤的小鼠单次注射200μL脂质体（注射剂量为342μg硼，每克体重17μg10B）化合物48小时后，肿瘤/血硼比率（2.76∶1）达到最高。双次注射方案即200μL脂质体注射（每次注射371μg硼，每克体重18.6μg10B）间隔24小时，肿瘤中硼清除延迟导致肿瘤组织中的硼水平达到峰值时间在第一次注射54小时后，硼浓度为每克肿瘤 67.8μg10B。肿瘤/血液硼比为 1.88∶1。到达96小时时，比率达到最高为 5.66∶1。与单次注射相比，双次注射方案在所有组织中获得了更高的硼峰值浓度。研究者以双注射方案为例，将54小时的时间点作为最合适辐射研究，通过改变中子照射持续时间进行研究。单次30分钟照射时，BNCT组治疗小鼠在第14天肿瘤体积仅增加了424%，纯中子照射的小鼠肿瘤体积增加了737%，对照组（既不注射也不照射）小鼠的肿瘤体积增加了1 551%。间隔7天施行两轮 BNCT照射后14天，肿瘤体积仅增加 186%；到了21天，增长也只有297%。围绕TAC和MAC改进给药方式以及改变中子辐照时间验证了BNCT在乳腺癌小鼠模型治疗中的可行性，为进一步实验设计提供了新思路。

Khan等［30］也验证了富硼脂质体制剂可提供高效载荷。实验设计一组EMT-6荷瘤小鼠接受中子辐射，另一组不接受辐射，只接受脂质体进行生物分布，富硼脂质体全身给药后54小时，肿瘤/血硼比为10∶1。BNCT显著抑制了EMT-6小鼠的肿瘤生长，抑制的显著点开始于第15天（P = 0.04），并持续增加，直到研究结束于22天（P = 0.001）。在给药方式上直接注射富硼脂质体的肿瘤在caspase活性方面的初始辐射效应高于全身注射富硼脂质体的肿瘤，直接瘤内注射富硼脂质体的总体肿瘤抑制率低于接受全身给药的小鼠。这可能是肿瘤内硼的输送产生急性效应。全身注射富硼脂质体对肿瘤生长的长期影响更高，这可能是由于免疫系统调节产生长期效应。但BNCT诱导产生免疫调节反应有待进一步研究。

4.3 其他载体作为硼递送剂的研发

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA） IX在乳腺癌及间皮瘤中高表达［31］，参与调节有利于肿瘤细胞生长和存活的细胞内pH值，同时促进肿瘤细胞侵袭［32］。基于CAIX抑制剂的新型抗肿瘤疗法在临床上受到了密切关注。Alberti等［33］设计一种磺胺基功能化碳硼烷（sulfonamido-functionalised-carborane，CA-SF）同时作为CAIX抑制剂和硼递送剂。为了评估BNCT结合CAIX 酶抑制剂能力的治疗效果，实验分为未经处理的细胞和经CA-SF处理的细胞，均经热中子辐照，结果表明经CA-SF处理的细胞在辐照处理后存活率显著降低，协同CA-SF+BNCT 治疗明显优于CA-SF单药治疗。协同毒性作用这一发现为BNCT与靶向细胞疗法联合治疗癌症提供了有力支撑。

据报道，已合成的姜黄素类似物五甲草酮-0（PGB-0）对乳腺癌细胞具有亲和力［34-36］，拥有良好的摄取、微分布、低外排能力，可作为BNCT治疗乳腺癌潜在的硼载体。然而这种化合物不溶于水，导致细胞摄取量低，适用性有限。Susidarti等［37-38］在此基础上成功开发了两种PGB-0-糖配方，即PGB-0-山梨醇（PGB-0-So）和 PGB-0-果糖（PGB-0-F），仅仅降低其溶解度，对细胞摄取没有影响。在Andoh 等［39］研究中提到将果糖与BPA结合形成果糖复合物（BPA Fr）用于研究人乳腺癌荷瘤小鼠骨转移的治疗效果。试验分BNCT组（BPA Fr给药后中子照射）、冷对照组（BPA Fr给药后无中子照射）、热对照组（给予生理盐水后中子照射）。给药1小时后，肿瘤内的硼浓度达到最高（22.8±5.8） ppm。通过量化BNCT后植入区域内的生物发光信号来评估肿瘤生长的情况。植入13周后，BNCT组的生物发光信号与热对照组有显著差异（P ＜ 0.05）。在无病理性骨折BNCT组中生物发光信号随着时间推移而减少，骨溶解随着时间的推移而减少。植入后8周的无病理性骨折BNCT组的H&E染色未检测到肿瘤细胞。肿瘤被选择性地破坏，周围的正常骨组织没有受到损害。实验表明BNCT不仅有助于减小肿瘤体积，而且有助于骨转移部位的骨重建。原因尚不清楚，需要进一步研究。

Utomo等［40］将 PGB-0溶解在乙醇中合成五甲草酮-0-醇（PGB-0-ol），表现出比 PGB-0 更高的水溶特性。使得在杀死癌细胞方面比PGB-0更有效。尽管PGB-0及其衍生物表现出作为硼载体的潜在优势，但在细胞摄取、在肿瘤组织中的微观分布以及细胞毒性方面未见大量研究数据，期待后续有更多相关报道。

5 总 结

国家发改委发布的2017年第1号公告已将BNCT系统及其靶向药物列入我国“十三五”国家战略性新兴产业发展规划。BNCT因其双靶向精准定位、治疗疗程短、发展性高、生物效应杀伤力强、适应症广成为高效的肿瘤精准治疗方式［41］。但在乳腺癌中的应用尚且处于细胞及动物实验阶段，临床阶段研究较少，发展缓慢。目前仍需进一步深入研究基于加速器型的BNCT系统、硼携带剂的药代动力学、中子能谱的评价以及相关的专业人才培养等问题，改进硼携带剂，提升肿瘤/正常组织硼浓度比提升BNCT疗效，以期为乳腺癌治疗提供新的可能和希望。