梯度淋洗离子色谱法同时测定西兰花中6种无机阴离子

高 健 范宝莉 亢原彬 李 煜 李玉梅 尚云涛*

(1.天津师范大学，天津 300387；2.西南林业大学，昆明 650224； 3.天津渤海望亚涂料有限公司，天津 301735)

西兰花是十字花科芸薹属重要经济作物，是我国人民餐桌上常见蔬菜，并广泛种植于我国大部分地区如华北、中东部及东南沿海等。西兰花营养成分丰富，富含多种抗氧化物质、各类维生素、微量元素、膳食纤维及硫代葡萄糖苷等对人体健康有益的生物活性物质[1]。

西兰花中各种离子成分较为丰富。据报道，人体硝酸盐总摄入量中蔬菜类食物所占比例较高[2]。研究表明，大量食用高硝酸盐含量的蔬菜，可能导致胃癌、肠癌等恶性肿瘤发生率提高[3]。而人体摄入的硝酸盐还可能在一定条件下被还原为危害性更强的亚硝酸盐。亚硝酸盐的氧化性较硝酸盐强，如过量摄入可能会严重影响红细胞供氧能力，甚至威胁生命[4]。亚硝酸盐还是强致癌物亚硝胺的前体物质，现已证实亚硝胺是多种癌症的重要诱发因素[5]。在我国农业生产中，广泛存在过量施用氮肥以达到增产目的，而大量施用的氮肥又直接导致了农产品中硝酸盐含量升高[6]。而农产品采收后的储藏、处理、运输等环节也可能使其中的硝酸盐含量升高。而十字花科类蔬菜因其特有的对氮元素吸收转化特性，使得其农产品中硝酸盐含量可能较高[7]。西兰花作为重要的十字花科蔬菜，其硝酸盐和亚硝酸盐等无机阴离子含量受到广泛关注[8]。因此，建立一种西兰花中各类无机阴离子的定量分析方法，将可以为完善蔬菜食品安全检测及质量控制提供检测方法和技术。

据报道，氯离子、硝酸盐、亚硝酸盐、溴离子、硫酸盐、磷酸盐等无机阴离子的分析检测技术有分光光度法[9]、电感耦合等离子体质谱法和离子色谱法[10]等。其中离子色谱法因其在定量分析、检出限、分析效率等方面所具有的显著优势，已在各类食品无机阴离子定性定量分析中得到广泛应用。李倩等[11]以KOH(30 mmol/L)为流动相，建立了同时检测果蔬中5种阴离子的方法。鲁广秋等[12]建立了超声波辅助提取-离子色谱法检测不同产区臭灵丹中4种无机阴离子含量的方法，检测结果准确可靠，分析效率高。魏泉增等[13]建立以碳酸钠溶液(3.6 mmol/L)为淋洗液同时检测茶叶中4种无机阴离子的方法，以高效、精确分析红茶、绿茶中阴离子含量。目前，在食品检测领域利用离子色谱梯度淋洗技术分析肉制品和香肠中的亚硝酸盐和硝酸盐并取得了理想的检测效果[14]。植物样品中离子成分较为复杂，且含量差异较大，在等度淋洗条件下样品中某些高含量离子组份可能会对其他离子的定量分析产生严重干扰。本研究采用梯度淋洗技术以有效提高各离子组份检测灵敏度，改善定量分析准确性，实验结果较为理想。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

本研究所用西兰花均采购自农贸市场或超市。

KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4均为基准试剂，甲醇(色谱纯)；固相萃取小柱(C18，500 mg，3 mL)，超纯水电阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器与设备

DIONEX ICS-2100型离子色谱仪、Supelco固相萃取仪、Milli-Q超纯水机。

1.3 离子色谱分析体系

DIONEX Ion Pac AS11-HC(4 mm×250 mm)分析柱，DIONEX Ion Pac AG11(4 mm×50 mm)保护柱，4 mm AERS 500自动再生抑制器，淋洗液流速1.0 mL/min，抑制器电流80 mA，25 μL定量环，KOH淋洗液在线发生器，淋洗液浓度梯度见表1，电导检测器，柱温箱温度30 ℃。

表1 梯度淋洗程序

1.4 标准溶液制备

精确称取KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4配制系列混合标准溶液。

1.5 样品前处理

称取20 g(精确至0.001 g)西兰花，洗净、破碎，加30 mL超纯水研磨后定容至250 mL，超声频率20 kHz、超声功率120 W，辅助提取15 min，再经10 000 r/min 离心15 min，取离心后上清液经0.45 μm滤膜过滤，收集滤液。C18固相萃取小柱加入10 mL甲醇、10 mL超纯水活化，静置15 min。将滤液以2～3 mL/min流速通过C18固相萃取小柱，舍弃最初洗脱的约3 mL洗脱液，收集剩余洗脱液后再次经0.45 μm滤膜过滤进行色谱分析。

2 结果与分析

2.1 色谱分析条件

离子色谱梯度淋洗液分离体系进行优化后最终确定淋洗液梯度程序如表1所示，流速为1.0 mL/min，抑制器电流80 mA为最适KOH梯度分析体系。实验结果表明，该体系下6种无机阴离子色谱峰峰形较好，各组份间分离度高、干扰少，定量分析准确度高(图1、2)。

图1 6种无机阴离子标准溶液离子色谱图Figure 1 Ion chromatogram of 6 inorganic anions standard solution.

2.2 抑制器电流的选择

抑制器作为离子色谱重要模块可以显著降低背景电导，提到检测灵敏度。抑制器电流过低会导致背景电导升高，影响定量分析的精确性。而抑制器电流过高时虽可以达到较为理想的背景电导抑制效果，但可能降低抑制器寿命，增加检测成本。本实验对离子色谱抑制器电流进行了优化，重点考察了抑制器电流50～100 mA条件下系统背景电导值，当抑制器电流过低时系统背景电导明显上升，当抑制器电流过高时背景电导趋于平衡，过高的抑制器电流并没有起到更好的抑制效果。本实验最终确定80 mA为最适抑制器电流，其在梯度淋洗浓度变化条件下有效降低背景电导值(见表2)，提升检测灵敏度，又对抑制器有一定的保护作用，延长使用寿命。

图2 西兰花样品离子色谱图Figure 2 Ion chromatogram of broccoli sample.

表2 不同抑制器电流下背景电导变化范围

2.3 亚硝酸盐痕量分析

在采用等度淋洗离子色谱法分析亚硝酸盐时，往往由于氯离子与亚硝酸盐保留时间较为接近，两者分离度较小，容易影响亚硝酸盐检测灵敏度。又因为蔬菜样品中氯离子含量通常显著高于亚硝酸盐含量，造成亚硝酸盐色谱峰极易被氯离子色谱峰遮蔽，影响亚硝酸盐定量分析结果，甚至无法有效检测亚硝酸盐含量。

实验通过构建离子色谱KOH梯度淋洗技术，提高了硝酸盐及亚硝酸盐检测灵敏度。对比常规等度淋洗离子色谱法(KOH淋洗液浓度为30 mmol/L)，如图3所示，当氯离子与亚硝酸盐浓度比为1∶100时亚硝酸盐色谱峰峰形受到严重影响(图3A)，检测灵敏度降低，无法达到基线分离标准，此时亚硝酸盐定量分析可能存在较大误差；当氯离子与亚硝酸盐浓度比为1∶1000时，氯离子色谱峰甚至完全覆盖亚硝酸盐离子色谱峰(图3B)，出现假阴性检测结果。而采用梯度淋洗离子色谱法，如图4所示，氯离子色谱峰与亚硝酸盐色谱峰分离效果明显改善，当氯离子与亚硝酸盐浓度比达到1∶1000，氯离子与亚硝酸盐分离效果较为理想(图4A)，当氯离子与亚硝酸盐浓度比达到1∶10000时，亚硝酸盐仍可以达到基线分离标准，且峰形及分离度均较好(图4B)，可见梯度淋洗法将显著提升亚硝酸盐检测灵敏度。

图3 等度淋洗法亚硝酸盐离子色谱图Figure 3 Equi-elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

图4 梯度淋洗法亚硝酸盐离子色谱图Figure 4 Gradient elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

2.4 线性范围及检出限

根据6种阴离子系列标准溶液测试结果，以各阴离子组分峰面积为纵坐标、浓度为横坐标建立线性回归方程，计算3倍信噪比作为各阴离子组分检出限(见表3)。结果表明，6种阴离子组分线性相关系数为0.999 5～0.999 9，检出限为0.021～0.036 mg/L，结果较为理想。

2.5 色谱体系验证

将西兰花样品平行测试5次，结果显示6种无机阴离子保留时间及峰面积相对标准偏差(RSD)均小于1.5%；将5份西兰花样品分别处理后上机检测，结果显示6种无机阴离子保留时间及峰面积相对标准偏差RSD均小于2.5%。结果表明，该色谱体系精密度及重复性均较好。

将3份西兰花样品处理后分别添加一定浓度的阴离子标样，分别检测样品本底值和检测值，计算并检验方法回收率。6种无机阴离子回收率范围95.7%～104%，回收率检验效果理想(见表4)。

表3 线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限

表4 样品加标回收实验

3 讨论

本研究采用梯度淋洗离子色谱法，首先在最初的20.0 min内KOH浓度为7 mmol/L，使氯离子等保留较弱的组分在这一阶段被充分洗脱分离，而其他中强保留组分仍然保留在色谱柱中；而后在20.1 min时KOH浓度立刻上升至30 mmol/L，使中强保留组份得到良好分离。同时，淋洗液KOH浓度的梯度变化可以有效降低在等度淋洗条件下可能出现的亚硝酸盐与氯离子的共洗脱效应，提高了亚硝酸盐与氯离子的分离度，避免了高浓度氯离子对亚硝酸盐离子的遮蔽和干扰。西兰花中含有比较丰富的多种化学和生物活性物质，如蛋白质、脂肪、糖类、维生素、色素、有机酸以及多种有机硫化合物等物质。如果不经过适当的样品前处理直接进行色谱分析，则极易对离子色谱柱、抑制器、检测器等重要仪器模块造成污染，直接影响分析准确性，降低仪器及耗材使用寿命。本研究选用固相萃取小柱(C18)对西兰花样品进行净化处理，减少了各类有机物、色素等物质对检测结果可能产生的影响，同时又保证了较为理想的回收率，在一定程度上延长了色谱柱和抑制器的使用寿命，降低设备维护成本。

4 结论

建立了一种利用梯度淋洗离子色谱技术分析西兰花中6种无机阴离子的检测方法。采用KOH梯度淋洗技术，提高了各组份检测灵敏度、检出限低、峰形对称性好、能够实现阴离子痕量分析、分析效率高、可以满足西兰花中多种无机阴离子高效、精确检测需求。