分子荧光光谱法测定富硒大米中的痕量硒

罗建民 彭翠红 杨智威

(韶关学院 化学与土木工程学院，广东 韶关 512005)

硒是人类和动物必需的微量元素，它是红细胞中谷胱甘肽过氧化物酶的一种成分。其主要功能是参与酶的合成，保护细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤，具有抗癌、解毒、护肝和提高人体免疫力的保健功能[1]。20世纪90年代初，中国总膳食结构调查显示，居民每日膳食硒平均摄入量为43.3 g/d，低于中国营养学会推荐的下限(50 g/d)[2]，我国有2/3的国土和地区处于缺硒状况，通过天然食物获取硒，远远不能满足人们对硒的需要，同时，大米在国内的相当一部分地区，还是每天必不可少的食物。因此，分析不同地区富硒大米的硒含量有着重要的意义。

硒元素的主要分析方法有原子吸收光谱法包括石墨炉原子吸收光谱法和氢化物发生原子吸收光谱法[3]、电化学分析法包括溶出伏安法[4]、极谱法以及电位分析法[5]、荧光光谱法包括分子荧光光谱法及氢化物-原子荧光谱法[6]。痕量硒的测定方法中，可见分光光度法和比色法[7]所用的仪器设备操作简单，但灵敏度低，试剂不稳定；石墨炉-原子吸收光谱法[8]的检测灵敏度相对较低，受背景干扰严重，稳定性差；电化学方法[9]是近年来发展快速的测定方法，灵敏度较高，但存在干扰严重的问题。目前报道富硒大米中硒含量的检测，主要采用电感耦合等离子体质谱法和原子荧光光谱法，这两种方法的准确度、灵敏度高，但这两种方法仪器设备比较贵，难以在基层实验室推广。分子荧光光谱法也具有上述所说的优点，但用来测定富硒大米中硒含量研究的文献却很少，因此本文拟采用分子荧光光谱法测定富硒大米中的痕量硒，通过探究体系酸度pH值、水浴反应时间、DAN用量以及表面活性剂等对体系荧光强度的影响，确定分子荧光光谱法中痕量硒的最佳测定条件，将方法应用于三种富硒大米中痕量硒的测定。为痕量硒的分析及人们在饮食过程中摄入适量的硒，合理搭配膳食、保障人体健康提供方法及数据参考。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

硒标准储备溶液(100.0 μg/mL)，使用时用1%的盐酸溶液稀释成0.05 μg/mL硒标准使用液，备用；

2，3-二氨基萘(DAN) 溶液(1 g/L)、EDTA-盐酸羟胺混合液：参照GB/T 5009.93-2017《食品中硒的测定方法》配制；CPB(溴化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、CPC(氯化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、DTAB(十二烷基三甲基溴化铵，1.0×10-5mol/L)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、盐酸羟胺、环己烷、高氯酸、硝酸、盐酸均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。

1.2 主要仪器及工作条件

F-380型分子荧光光度计(港东科技公司)。工作条件：电压340 V，灯电流100 mA，狭缝宽度10 nm，扫描速度1 200 nm/min，增益1，重复1次。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将大米样品去除杂物后，用石英研钵充分磨碎，磨碎后的样品储存于塑料瓶中；称取1.0 g(精确至0.000 1 g)试样置于锥形瓶中，加5 mL硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及几粒玻璃，盖上表面皿浸泡过夜。次日于电热板上消解至澄清透明，冷却后定容(同时做试剂空白实验)。

1.3.2 硒的测定

准确移取4.00 mL 50 μg/L硒标准溶液于锥形瓶中，加入15.00 mL EDTA-盐酸羟胺混合溶液，用盐酸溶液(1+9)调节pH值，在暗室中加入一定量 DAN溶液，水浴锅加热至60～100 ℃，加热一定时间，冷却后加入3.00 mL环己烷，2.00 mL表面活性剂溶液(1.0×10-5mol/L)，振摇5 min，将溶液全部移入分液漏斗中，静置分层后，将上层的环己烷移入比色管中，测量环己烷萃取液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 硒测定的荧光光谱及测定波长选择

按实验方法得到萃取测定液，在300～400 nm波长范围内进行扫描得激发光谱，500～600 nm波长范围内进行扫描得发射光谱，硒(Ⅳ)与DAN在酸性条件下反应生成强荧光物质，其最大激发波长和发射波长为λEx/λEm= 373 nm/521 nm，如图1所示。因此，选择521 nm作为荧光测定波长。

图1 硒测定的激发与发射光谱Figure 1 The excitation and emission spectra of Se determination.

2.2 硒的荧光测定条件选择

2.2.1 DAN用量对体系荧光强度的影响

准确移取4.00 mL硒标准溶液(50 μg/L)加入5个锥形瓶中，在暗室中分别加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL DAN溶液(1 g/L)，按照实验方法，其他条件不变，加入3.00 mL环己烷、2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)萃取后，测定环己烷层萃取液的荧光强度，如图2所示，在加入DAN 2.00～3.00 mL时，体系荧光强度趋于稳定，当DAN加入量为3.00 mL时，体系荧光强度最强。故实验选择DAN用量为3.00 mL。

图2 DAN用量对硒测定荧光强度的影响Figure 2 Effect of the amount of DAN on fluorescence intensity.

2.2.2 表面活性剂对体系荧光强度的影响

选择3种阳离子表面活性剂十六烷基溴化吡啶(CPB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)以及十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)探究其对硒测定体系荧光的影响。分别准确移取4.00 mL硒标准溶液(50 μg/L)加入5个锥形瓶中，按照实验方法，加热冷却后，分别加入3.00 mL环己烷，2.00 mL 1.0×10-5mol/L的CPB、CPC及DTAB萃取分液后，测量环己烷萃取液的荧光强度，结果见表1。

表1 不同表面活性剂对体系荧光强度的影响

由表1可以看到，在加入不同的阳离子表面活性剂后，体系的荧光强度相较于不加表面活性剂都有一定程度的增强，其中加入CPB后，体系荧光强度的增加幅度最大。如图3所示加入CPB后，体系荧光强度明显增强，其原因是添加表面活性剂后与荧光物质形成了胶束，形成的胶束能增大体系的黏度，从而降低了在荧光反应时的碰撞猝灭[10]。故实验选择加入CPB为表面活性剂。

图3 加CPB前后硒测定的荧光光谱Figure 3 The fluorescence spectra of Se determination before and after adding CPB.

2.2.3 溶液酸度对体系荧光强度的影响

由于荧光物质自身为弱碱或弱酸，荧光强度随分子和离子在不同酸度水平下平衡的变化而变化，因此按照实验方法，只改变体系的pH值，分别用盐酸溶液(1+9)调节至pH = 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，其他条件不变，加入2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)，测量环己烷萃取液的荧光强度，结果如图4所示，当pH=2.0时，体系荧光强度最大。故实验选择溶液的pH值为2.0。

图4 pH值对硒测定体系荧光强度的影响Figure 4 Effect of pH on fluorescence intensity.

2.2.4 水浴反应温度对体系荧光强度的影响

按照实验方法，只改变水浴反应温度，分别在水浴温度60、70、80、90、100 ℃下加热10 min，其他条件不变，测量环己烷萃取液的荧光强度，结果如图5所示。结果表明当水浴温度在70～90 ℃时，体系荧光强度趋于稳定，在80 ℃ 下进行水浴加热时体系的荧光强度最高。故实验选择水浴温度为80 ℃。

图5 水浴温度对体系荧光强度的影响Figure 5 Effect of water bath temperature on fluorescence intensity.

按照实验方法，只改变水浴反应时间，即在水浴温度80 ℃下分别加热5、10、15、20、25 min，其他条件不变，最后用环己烷萃取液测量溶液的荧光强度，结果如图6所示。当水浴反应时间在5～10 min时，体系荧光强度趋于稳定，反应时间为10 min 时，体系荧光强度最大。故实验选择反应时间为10 min。

图6 水浴反应时间对硒测定体系荧光强度的影响Figure 6 Effect of water bath time on fluorescence intensity.

2.3 稳定性与干扰实验

2.3.1 稳定性实验

按照实验方法进行硒测定体系的稳定性实验，将环己烷萃取液分别在5、10、15、20、30、40、60 min 时测定其荧光强度，结果见图7，表明在1 h内体系的稳定性良好。

图7 硒测定体系的稳定性Figure 7 The stability of Se determination.

2.3.2 干扰实验

按实验方法测定0.2 μg/mLSe(Ⅳ)，相对误差≤±5%时，考察了Hg2+、Cu2+、Pb2+对硒测定的干扰，在高于50倍硒量的汞离子、铜离子及铅离子存在量下不会对硒测定产生干扰。

2.4 硒测定的标准曲线和检出限

分别吸取0、0.20、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 硒标准溶液(50 μg/L)，按照实验方法，得到硒测定的标准曲线，如图8所示，硒测定的线性范围为0～0.067 μg/mL，其线性回归方程If=1775c-0.3165，相关系数r=0.9991。进行11次空白实验，标准偏差σ为3.81×10-2μg/mL，按照cL=3σ/k计算该方法检出限为6.5×10-4μg/mL，表明该方法测定硒灵敏度较高。

图8 硒测定的标准曲线Figure 8 The standard curve of Se determination.

2.5 样品分析

2.5.1 大米中硒含量的测定

通过电子商城等途径采购了三种产自不同地区不同品牌的富硒大米，分别测定其中的硒含量。如表2所示，来自湖北的1#富硒米中硒含量最高，为283 μg/kg，湖南的2#为182 μg/kg，来自黑龙江五常地区的最低，为126 μg/kg，但都达到了包装上营养成分表中关于硒含量的营养指标要求。

表2 不同种富硒米中硒含量

2.5.2 加标回收实验

在三种富硒大米消解后的样品中加入不同量的硒标准溶液，按实验方法测定硒含量，平行测定5次，计算其加标回收率，结果如表3所示，三种样品的回收率在87.8%～107%，均符合测定要求，方法可行。

表3 加标回收实验结果

3 结论

优化了分子荧光光谱法测定痕量硒的实验条件，其最佳测定条件：水浴温度 80 ℃下加热10 min，pH值控制在2.0，DAN用量为3.00 mL、加入CPB阳离子表面活性剂；硒测定的方法检出限低，提高了测定硒的灵敏度；将该方法应用于三种产自不同地区的富硒大米中痕量硒的测定，其相对标准偏差均小于3.0%，表明测定结果良好。