荧光免疫分析技术检测食品中AFB1的研究进展

蔡爱丽，鲁 迨，石星波，赵 倩，邓洁红

（湖南农业大学 食品科技学院，长沙 410128）

0 引言

黄曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，AFB1）主要是由黄曲霉和寄生曲霉在温暖湿润条件下产生的芳香代谢物。花生、玉米、大米等食物，极易被AFB1污染。AFB1具有高度致癌性和致畸性，能够抑制遗传物质的合成，破坏人体内的酶，导致生理损伤［1-2］。根据 GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定，我国的小麦、大麦等谷物的AFB1检测限量为5 μg/kg。而欧洲委员会更是规定了所有谷物和谷物衍生产品中AFB1最大污染水平不超过2 μg/kg，以保护消费者健康和食品安全。

传统AFB1检测方法有高效液相色谱法、薄层色谱法和气相色谱法等［3］。尽管这些方法已经取得了许多进展，但考虑到AFB1低许可水平和巨毒性，寻找新的方法来提高检测技术的简便性、选择性和灵敏性仍然是一个挑战。

免疫分析是利用抗体特异性识别抗原的特性对目标物进行定性或定量的分析方法。COONS将荧光信号与抗原抗体特异性反应相结合提出了荧光免疫分析法。荧光法具有灵敏度高、操作简便、快速等优势，在各种化合物的检测中被广泛应用［4］。近些年来，兼容高灵敏荧光输出信号和高特异性免疫分析的AFB1传感检测平台，成为研究热点。

拟聚焦于AFB1传感检测平台的不同检测原理，本文将荧光免疫分析法分为荧光免疫吸附法（Fluorescent-linked immunosorbent assay，FLISA）、基于荧光纳米颗粒的侧流免疫分析法（Lateral flow immunoassays，LFI）、免疫磁分离荧光检测法（Immunomagnetic separation fluorescence assay）和适配体免疫荧光分析法（Aptamer immunofluorescence assay）4种，为研究新的AFB1检测传感器提供思路。

1 荧光免疫吸附法检测AFB1

FLISA在传统酶联免疫吸附法的基础上，利用荧光材料作为信号标记，避免有色样品造成假阳性信号，使检测结果更加准确［5］。

1.1 基于荧光基团的FLISA

利用具有荧光淬灭作用的材料对荧光信号进行淬灭可以构建多种生物传感器［6］。LU等［7］在磁纳米颗粒（Magnetic nanoparticles，MNPs）上修饰了与适配体互补的带有荧光染料的DNA链，基于MNPs的荧光淬灭效应，Cy5的荧光被淬灭。加入AFB1后，DNA链掉落。通过测量回收DNA链上的荧光，构建了超灵敏的荧光检测传感器检测AFB1，LOD为0.54 fg/mL，远低于之前报道。

1.2 基于量子点的FLISA

高荧光信号输出的量子点（Quantum dot，QDs）可以代替容易受到环境影响的生物酶进行信号放大。ZHANG等［8］用产率高且稳定的碲化镉量子点（CdTe QDs）代替酶标与AFB1的单克隆抗体偶联，AFB1浓度与被检测出的CdTe QDs荧光强度呈反比。该方法的检测限为0.016 ng/mL。LI等［9］将红色荧光的CdSe/ZnS QDs标记在单克隆抗体上作为结合和检测探针，不仅表现出优异的分析性能，而且节省大量时间。

2 基于荧光纳米颗粒的测流免疫分析法检测AFB1

常见的LFI通过在硝化纤维素膜上固定抗原和抗体，分别作为检测线（T线）和控制线（C线），用T线与C线的荧光强度比值进行测定分析［10］。荧光纳米颗粒如QDs、染料掺杂的聚苯乙烯纳米颗粒和上转换纳米粒子（Upconversion nanoparticles，UC NPs）都具有优良的发光性能和光稳定性，被用于开发高灵敏的LFI传感器。

2.1 量子点

QDs的强发光、宽吸附和窄对称光致发光光谱等特殊的光学特性使其在AFB1检测中的应用前景十分广阔。例如，CdSe/ZnS QDs连接到抗AFB1抗体上作为LFI抗体探针，可以提供荧光信号［11］。此外，JIANG 等［12］基于 QDs和花状金纳米粒子（AuNFs）之间的内滤效应，开发了一种荧光淬灭型的LFI检测大豆酱中的AFB1。

在复杂的生物环境中，QDs的化学稳定性不强。研究人员设计了一种嵌有大量QDs的聚合物纳米微珠（QBs），通过增加QDs的数量来放大发光信号，提高 QDs的稳定性［13］。JIA等［14］利用QBs与AFB1抗体偶联作为荧光探针，可用于现场检测莲子中的AFB1。同时，QBs和磁性纳米球合成的磁性荧光珠在保留约45.4%的离子饱和磁化强度的基础上，其荧光发射强度比相应的量子点强约226倍［15］。用于检测酱油提取物和老抽中AFB1时，灵敏度分别为3 pg/mL和49 pg/mL。

2.2 染料掺杂聚苯乙烯纳米颗粒

近年来，研究发现将不同种类的荧光染料掺入聚苯乙烯颗粒内部，可以制备稳定、荧光强的荧光微球（Fluorescent microsphere，FMs），减弱光降解或光漂白现象［16］。WANG 等［17］优化反应条件使分析条带具有更明亮的颜色，解决了条带上的暗背景问题，消除样品的颜色干扰，可以用肉眼分析玉米中的AFB1含量。镧系化合物Eu（III）掺杂的聚苯乙烯纳米颗粒作为另一种荧光微球（TRFMs），可以通过延迟时间从背景荧光信号中分辨出有用的荧光信号。ZHANG等［18］研制了一种基于TRFMs的色谱时间分辨荧光免疫分析法的便携式免疫传感器，用于食品和饲料样品中AFB1的现场灵敏检测。因此没有激发光源引起的噪声干扰，提供了放大的正信号和低信噪比。TRFMs还可以检测酱油中的AFB1，做到现场即时检测［19］。

2.3 上转化纳米粒子

UC NPs具有较长的发光寿命，与传统的有机染料和QDs相比优势显著。斯托克斯位移大、发射峰尖锐、发光寿命长、无光漂白等独特的光学特性使UC NPs具有低信噪比［20］。

由于AFB1的分子结构小，抗原表位有限，ZHAO等［21］基于竞争免疫法构建了AFB1的LFI传感器。在检测过程中，AFB1与AFB1/牛血清蛋白竞争。随着样品中AFB1量的增加，UC NPs/AFB1/抗体偶联物在T中积累较少，导使T线上信号减少。该方法用于花生、水稻、玉米等的AFB1检测时表现良好，对AFB1的检测灵敏度为0.03 μg/L。此外，适配体功能化的多色上转换纳米颗粒还可以作为高灵敏和精确检测多个目标的荧光探针，可以在不发生交叉反应的情况下，通过不同的颜色通道对不同的靶标进行快速、灵敏的分析［22］。

3 免疫磁分离荧光检测法检测AFB1

MNPs的生物相容性好，比表面积大，在免疫化学反应后施加磁场，可以快速分离反应物，在真菌毒素的检测应用中十分普遍。SHU等［23］将AFB1抗体固定在MNPs表面构建无标记免疫分析平台，通过免疫磁分离（Immunomagnetic separation，IMS）技术选择性地从样本基质中捕获和富集AFB1。被抗体捕获的AFB1在365 nm紫外灯照射下会产生具有强荧光的衍生物，荧光增强。

XIE 等［24］将 AFB1的半抗原偶联 MNPs作为传感探针，多孔C3N4纳米薄片为荧光探针构建AFB1检测平台。利用IMS技术分离通过免疫反应结合的复合物，便于荧光强度的测定。但是该方法由许多组件和步骤组成，昂贵且费时。为了解决这个问题，BECHEVA等［25］提出了另一种基于IMS的AFB1免疫荧光检测方法，由MNPs，AFB1/牛血清白蛋白和异硫氰酸荧光素的荧光偶联物2个部分组成。该方法样品量小，灵敏度高，检测时间短。利用IMS特性，不仅可以测定沉淀中与免疫磁珠结合的荧光偶联物的荧光强度，还可以测定上清液中未结合的荧光偶联物的荧光强度［26］。另外，半抗原修饰的MNPs作为免疫传感探针，与AFB1在样品溶液中形成免疫竞争，用于定量AFB1含量时高效且灵敏［27］。

4 适配体免疫荧光分析法检测AFB1

与制备困难和高成本的抗体相比，通过配体指数富集系统筛选设计的适配体，在大多数环境条件下具有更强的化学稳定性，更长的保质期，易于修饰，易于合成荧光型的生物传感器，被认为是应用于检测技术的理想候选体［28］。

4.1 适配体修饰荧光信号

CHEN等［29］将荧光基团FAM修饰在AFB1适配体上，淬灭基团TAMRA修饰在与适配体部分互补的DNA链（cDNA）。在AFB1缺失的情况下，适配体与cDNA结合，荧光团和淬灭剂靠近，诱导荧光淬灭。加入AFB1后，触发cDNA的释放，荧光强度随着AFB1浓度的增加而增加。同理，将FAM和TAMRA同时修饰在AFB1适配体上，操作更为简单，并且灵敏度更高［30］。聚集诱导发射（AIE）染料也能用于标记核酸探针，与传统的DNA嵌入染料相比，AIE染料和末端标记的荧光团之间的荧光共振能量转移（FRET）过程，将在结构转换过程中引起距离效应，进一步放大响应信号，提高灵敏度［31］。

4.2 适配体修饰二氧化硅纳米颗粒

二氧化硅纳米颗粒（Silica nanoparticles，SNPs）因其在不同介质中的稳定性、分散性、生物相容性和低成本等特点，在传感器中有着很大的作用。SNPs不仅可以作为载体，还能作为N-甲基中卟啉IX（NMM）的荧光增强剂，提高检测灵敏度。在AFB1存在下，含有适配体的发夹结构被拆解，形成G-四联体结构。NMM荧光团的环境发生变化，其荧光强度被放大，LOD 为 8 pg/mL［32］。TAN 等［33］基 于 介 孔 SNPs（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs），设计一种新颖、简单且无标记的适配体生物传感器，用于检测AFB1。适配体被用作分子识别探针和“门控分子”，固定在氨基化MSNs的表面，以防止颗粒内部的荧光染料泄漏。存在AFB1时，“门”被打开释放荧光信号。结果表明，荧光强度与AFB1的浓度呈正相关，检出限低至0.13 ng/mL。

4.3 适配体修饰氧化石墨烯

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）具有巨大的表面积和强大的荧光淬灭能力［34］，基于GO对FAM的荧光淬灭效果，JOO等［35］将FAM修饰的适配体作为检测探针，研究开发了AFB1检测平台。随着AFB1浓度的增加，荧光强度呈线性下降。适配体修饰的GO生物传感器与荧光偏振法相结合检测AFB1时，具有抗光漂白、不敏感荧光波动等优点［36］。JIA等［37］利用GO 在能量和电子转移过程中能够淬灭季铵化四苯乙烷盐（TPE-Z）的荧光的特性，简单混合TPE-Z、AFB1适配体、GO和AFB1样品即可实现检测牛奶中的AFB1，弥补了奶杀菌不彻底时造成的毒素污染［38］。

与GO相比，纳米粒子功能化的GO可以增加分析物结合的有效表面积。LI等［39］将2个荧光团标记的发夹探针吸附在氧化石墨烯/金纳米复合材料（GO/AuNCs）上，加入AFB1后，适配体与AFB1特异性识别，茎环结构被打开，发生杂交链式反应，形成长链DNA双链体并从GO/AuNCs的表面解吸，荧光信号恢复。在最佳条件下GO/AuNCs能够淬灭94%的荧光，LOD低至0.03 pg/mL。

4.4 适配体修饰金纳米材料

纳米材料中，纳米尺度（1～100 nm）的金纳米材料因其高表体积比、优异的生物相容性、表面易修饰以及独特的光学和电子特性，已被应用于传感检测器等领域［40］。

4.4.1 适配体修饰球状金纳米颗粒

球状AuNPs（20～40 nm）的表面等离子体共振峰与荧光素的最大发射峰重叠，当荧光团靠近AuNPs时，荧光素与AuNPs之间的FRET会导致荧光淬灭，常被用于构建基于AuNPs的AFB1检测。WANG等［41］将AuNPs作为荧光淬灭剂，AFM标记的适配体作为荧光探针。存在AFB1时，AFB1与适配体的互补链进行竞争导致荧光恢复。然而，荧光素的小斯托克斯位移会产生高背景并导致低信噪比。LU等［42］发现用QDs代替荧光染料，与AuNPs之间进行FRET检测AFB1时，能够提高信噪比，LOD为20 pg/mL。

此外，AuNPs还可以作为信号载体。WANG等［43］合成AuNPs/DNA复合材料，利用末端脱氧核苷酸转移酶催化DNA聚合，荧光探针作为荧光信号被组装在AuNPs/DNA复合材料上进行信号放大，该策略表现出高灵敏度。

4.4.2 适配体修饰其他金纳米材料

与传统染料相比，金纳米簇（AuNCs）体积小、稳定性高、生物相容性好、荧光发射稳定。张莹莹等［44］基于Au3+与Hg2+之间的相互作用所导致的AuNCs荧光淬灭，以及Hg2+与AFB1之间的络合作用所导致的荧光恢复，建立了一种LOD为0.1 ng/mL的AFB1检测方法。KHAN等［45］首次使用双色AuNCs作为能量供体，分别偶联AFB1和ZEN适配体，WS2纳米片作为荧光淬灭剂合成信号探针，快速、灵敏地同时识别AFB1和ZEN。金纳米星（AuNSs）具有多尖锐分枝，更容易修饰和固定材料，同时还可以淬灭荧光。WEI等［46］利用AuNSs的特性，将FAM标记的与适配体互补的发夹DNA作为信号探针，提出了一种基于AuNSs的AFB1荧光适配体检测方法，在其他毒素存在下显示出良好的选择性。

5 结语

减少AFB1对食品的污染，快速、灵敏、特异的检测方法成为近年来的研究重点。本文综述以免疫荧光分析为基础检测食品中AFB1的方法及研究进展，如表1所示，将已开发的基于荧光免疫分析的AFB1检测平台分成了荧光免疫吸附法、基于荧光纳米颗粒的侧流免疫分析法、免疫磁分离荧光检测法、适配体免疫荧光分析法。一方面，荧光信号的出现克服了食品本身颜色对比色信号造成的影响，减少了假阳性信号的出现；另一方面，纳米材料可以给抗体及其他修饰基团提供更多的结合位点，放大信号，进一步提高检测灵敏度。同时，基于荧光免疫的LFI平台简单方便，在现场检测中具有很大的价值。

表1 AFB1荧光免疫分析技术的对比Tab.1 Comparison of AFB1 fluorescence immunoassay techniques

尽管荧光免疫分析技术被广泛用于检测食品中的AFB1，但是仍然存在许多缺陷。首先，抗体的昂贵需要开发新的技术和方法来减少抗体使用的数量；其次，纳米材料的商业化使用还需要更多的探索；再次，过量的MNPs会抑制量子点或荧光染料的荧光，使检测信号出现误差。而且，荧光漂白等问题使研发更稳定的荧光物质成为一个重要的研究方向。最重要的是，不同的食品基质需要不同的前处理方法，操作过程不够简洁；一些检测方法需要专业人员和昂贵的设备，只能用于实验室检测，等等。这些问题都需要更加深入的研究。