基于脑-肠-脊髓轴探讨针刺疗法对大脑中动脉阻塞模型大鼠肠道菌群的影响※

张忠平,丛 宇,张海月,马政涛,刘芷妤,尹继芳

(黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨150036)

中风为全球常见病之一,具有高发病率、高残疾率、高死亡率和不良预后特点[1]。缺血性中风(ischemic stroke,IS)患病率逐年上升[2]。目前,影响中风后恢复的主要因素是感染[3],针对IS后感染的相关研究仍未阐明其发生发展的确切机制。针刺疗法普遍应用于IS的恢复期治疗,效果良好[4],但其科学内涵尚不清楚。因此,寻找IS预防与治疗的新靶点,开展有效的个体化治疗是亟须开展的工作。本研究基于脑-肠-脊髓轴探讨针刺疗法对大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠肠道菌群的影响,现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 8～10 周龄的雄性Wistar 大鼠50只,体质量250～300 g,SPF 级。所有大鼠由哈尔滨医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号:SCXK(黑)2019-001],饲养在黑龙江省中医药科学院动物实验中心的动物养殖室,并按照实验要求,控温、给食、给水,适应饲养7 d。

1.2 实验分组 动物实验获得黑龙江省中医药科学院动物委员会批准(审批号:H20201001),按照研究方案进行。适应饲养后按照随机数字表法分成针刺组、手法组、电针组、对照组、假手术组,每组10只,体质量(280±20)g。若大鼠中途死亡则另选备用。

2 模型制备

针刺组、手法组、电针组采用改良线栓法[5]诱发局灶性脑缺血,制备MCAO 模型,制备后2 h拔出制备线恢复灌注。假手术组:进行MCAO 模型制备的手术操作,但不进行再灌注。对照组:未执行任何操作。

3 穴位、针具选择

穴位:百会、膈俞、脾俞、肾俞、后三里。穴位选择和针刺方法参照《实验针灸学》[6]。根据大鼠的分组和编号,每组大鼠将在每日的固定时间按顺序进行干预。针具:0.25 mm×25 mm 安迪牌一次性使用无菌针灸针[贵州安迪药械有限公司,黔食药监械(准)字2014第2270027号]。电针:华佗牌SDZ-V 型电针治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司,苏械注准20172270675)。

3 干预方案

3.1 针刺组 固定MCAO 模型大鼠,选取以上穴位,75%乙醇溶液常规皮肤消毒,术者右手持针灸针,推针速刺入穴,行捻转行针法1 min,针下有紧滞感后,不做任何操作,留针15 min,每日1次,连续14 d。

3.2 手法组 固定MCAO 模型大鼠,选穴同上,消毒同上。术者右手持针,推针速刺入穴,行捻转行针法1 min。针下得气后,行搓针手法,达到气满针摇为宜。留针15 min,每日1次,连续14 d。

3.3 电针组 固定MCAO 模型大鼠,选穴同上,消毒同上。术者右手持针,推针速刺入穴,行捻转行针法1 min,针下有紧滞感后,给予同侧膈俞、肾俞穴接电针治疗仪,膈俞接正极,肾俞接负极,断续波,频率2～10 Hz,通电15 min,每日1次,连续治疗14 d。

3.4 假手术组 每日陪同抓取、捆绑固定15 min,不进行针刺操作,连续14 d。

3.5 对照组 每日陪同抓取、捆绑固定每次15 min,不做任何针刺治疗,连续14 d。

4 实验观察

4.1 标本采集 干预后,收集不同组大鼠的粪便和肺组织,并采用16 S r DNA 测序技术检测肠和肺菌群的丰度和多样性。

4.2 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计量资料不符合正态分布时以中位数(四分位数间距)[M(QR)]表示,采用秩和检验；计数资料以只(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

4.3 结果

(1)肠道菌群丰度结构变化情况 在粪便组织中主要检测到的前5类菌门,依次为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门、疣微菌门。针刺组、手法组、电针组厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门丰度均高于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组高于针刺组、电针组(P＜0.05)。针刺组、手法组、电针组拟杆菌门、疣微菌门丰度均低于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组低于针刺组、电针组(P＜0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肠道菌群丰度结构变化情况[%,M(QR)]

(2)肺内菌群丰度变化情况 在肺组织中主要检测到的前5类菌属,依次为乳酸杆菌、放线菌、瘤胃球菌、梭杆菌、大肠杆菌。针刺组、手法组、电针组乳酸杆菌、放线菌、瘤胃球菌、梭杆菌、大肠杆菌丰度均低于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组低于针刺组、电针组(P＜0.05)。见表2。

表2 5组大鼠肺内菌群丰度变化情况[%,M(QR)]

5 讨论

中风病在全世界范围内发病率和死亡率逐年增高,中风主要并发症是肺炎或肺部感染[7]。细菌感染在中风患者中非常普遍。尽管微量吸入物在中风后肺炎中有潜在的作用,但研究发现,在中风后发生感染的患者身上检测到的多数微生物是肠道中常见的共生细菌,通过高通量16 S rDNA 基因扩增序列的确定和生物信息学分析,证明针刺疗法可以有效地调节肠道菌群[8]。基于此,笔者课题组推测“针刺疗法可以通过脑-肠-脊髓轴调节大脑,肠道和菌群”。脑-肠-脊髓轴由肠道菌群、肠道和神经系统组成,包括中枢神经系统、自主神经系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴、神经递质、神经肽、肠道微生态、血脑屏障。这3个系统相互作用,调节一系列的病理、生理活动。研究发现,神经系统可通过肠固有层的神经元、免疫细胞直接影响肠道菌群分泌信号传导因子,从而间接调节肠道运动和分泌功能,有效调节肠道微环境[9]。由于DNA测序和生物信息学技术的进步,近年来对微生物区系的研究,特别是对肠道微生物区系的研究,引起了医学界的高度重视。研究发现,肠道菌群失衡是影响IS的重要代谢机制,通过有效调节肠道菌群可以影响肠外靶器官(如心、脑、肾等)的功能[10]。调节肠道微生态的新方法将成为IS治疗的新方向,但是肠道菌群介导的免疫炎症细胞因子和神经递质如何调控IS的病理过程,具体机制仍不清楚[11]。

在IS动物模型中,肠道菌群种类明显降低,致病杆菌过度增生[12]。肠道菌群失调通过调节免疫功能影响IS的炎性反应和预后。近年来研究发现,与无症状的动脉粥样硬化患者相比,IS患者有更多的机会感染致病菌,如肠杆菌和巨球菌,而共生菌如类杆菌、普鲁斯氏菌和粪链球菌的数量减少[13]。另一项临床研究中表明,与脑缺血人群和正常人群相比,IS人群肠道菌群多样性显著降低,其中大肠埃希菌、巨单胞菌、杆菌、双歧杆菌和瘤胃球菌属数量显著增加,而埃克曼菌、布氏杆菌和粪便杆菌数量显著减少[14]。这些研究已充分证实IS与肠道菌群关系密切,但在IS发生发展中起关键作用的菌株和代谢物的变化仍需进一步挖掘和分析。

相关研究证明,针刺疗法可以通过穴位配伍和针刺手法,改善肠道菌群多样性和有益菌群数量,从而调节机体功能,起到治疗作用[15]。本研究选取百会、膈俞、脾俞、肾俞、后三里穴,采用搓针手法,鼓舞气血生化。百会穴位于颠顶,为诸阳之会,经脉于此入络于脑,沟通十二经气血,针刺百会可抑制血管性痴呆模型大鼠海马区神经元凋亡及改善其神经元突触功能[16]；电针后三里穴能显著上调肠道益生菌丰度水平[17]；膈俞、脾俞、肾俞位于脊柱两侧,可调节肠道的运动、分泌,达到调控肠道微环境的目的[18]。通过不同穴位配伍,有效沟通脑-肠-脊髓轴通路,可通过调节肠道菌群变化而起到改善脑功能的作用。

本研究使用16S rDNA 测序技术分析IS后的细菌群落结构,结果发现在粪便组织中主要检测到的前5类菌门,依次为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门、疣微菌门。针刺组、手法组、电针组厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门丰度均高于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组高于针刺组、电针组(P＜0.05)。针刺组、手法组、电针组拟杆菌门、疣微菌门丰度均低于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组低于针刺组、电针组(P＜0.05)。在肺组织中主要检测到的前5类菌属,依次为乳酸杆菌、放线菌、瘤胃球菌、梭杆菌、大肠杆菌。针刺组、手法组、电针组乳酸杆菌、放线菌、瘤胃球菌、梭杆菌、大肠杆菌丰度均低于假手术组和对照组(P＜0.05),且手法组低于针刺组、电针组(P＜0.05),表明针刺可以改善模型大鼠的菌群失调。肠道菌群丰度的下降和菌群结构的变化是IS发生的重要原因。以上结果均表明,采用针刺疗法治疗IS过程中肠道微生物的多样性发生变化,提示该法可能对菌群的变化具有一定的抑制作用。相关研究发现,针刺可以增加肠道中双歧杆菌和乳酸菌等有益细菌的数量,减少大肠杆菌的数量[19]。电针百会、腰奇穴可提高大鼠肠道厚壁菌门丰度,其机制可能与肠道菌群结构得到调节和恢复有关[20]。

综上所述,本研究通过脑-肠-脊髓轴,观察针刺疗法干预MCAO 大鼠后的肠道菌群变化和移位变化情况,实验过程无差错,但在相关课题的延伸上应需完善,如增加实验样本量以验证数据的准确性,在临床进行入组研究以评估肠道菌群随针刺调节的变化情况。