高海拔地区不同抗原修复法对免疫组化染色的影响

徐开敏，陈 芸，孟庆印

抗原修复是免疫组化技术中最关键的步骤[1]。近年随着各医院病例大幅增多，病理技术对免疫组化自动化的需求也日益显著。云南省为高海拔地区，我院地处海拔1 900 m，常压下水的沸点为94.3 ℃。全自动免疫组化染色仪均无高压功能，抗原修复温度最高只能达到水的沸点。受高海拔和抗原修复温度影响，云南省免疫组化自动化发展较慢，使用全自动免疫组化染色仪的单位极少。随着科技的发展，一些新技术和新产品的出现，逐渐解决了高海拔地区对免疫组化自动化发展的限制。本文采用不同抗原修复方法进行实验，以寻找高海拔地区的最佳染色方法，提高免疫组化的准确性和可靠性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年1月～2021年1月云南省肿瘤医院病理科乳腺癌、肺癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌石蜡样本合计100例，切片厚4 μm。

1.2 试剂Lumatas全自动免疫组化染色仪、抗原修复液、一抗、检测系统，均购自福州迈新公司。

1.3 方法选用科室常用的100种抗体作为测试对象，每种阳性组织切片各切4份，随机分为微波组、水煮组、高压组、仪器组。其中，仪器组的免疫组化染色由仪器自动完成；微波组、水煮组、高压组均为手工操作，抗原修复液均为EDTA(pH 9.0)。采用温度探测器测试微波组、水煮组、高压组、仪器组最高抗原修复温度分别为89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，抗原修复时间分别为20、20、1.5、20 min。手工免疫组化染色步骤：组织经脱蜡、水化、抗原修复后滴加50 μL过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS冲洗3 min×2次；滴加50 μL一抗，室温孵育60 min，PBS冲洗3 min×2次；滴加50 μL二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3 min×2次；滴加50 μL DAB，室温孵育5 min，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。

2 结果

2.1 抗体敏感度比较实验结果显示，100种抗体染色强度从高到低排序：高压组>仪器组>水煮组>微波组(表1)。微波组假阴性率为10%，水煮组假阴性率为3%，且其它抗体的染色强度明显弱于高压组。仪器组的染色强度介于水煮组和高压组之间(图1)。

图1 不同抗原修复对TdT染色强度的影响：A.高压组；B.仪器组；C.水煮组；D.微波组 图2 不同抗原修复对CK7背景着色的影响：A.高压组；B.仪器组；C.水煮组；D.微波组 图3 不同抗原修复对ER脱片的影响：A.高压组；B.仪器组；C.水煮组；D.微波组 图4 不同抗原修复对p63皱褶的影响：A.高压组；B.仪器组；C.水煮组；D.微波组

表1 不同抗原修复对免疫组化染色的影响

2.2 抗体特异性比较实验结果显示，EDTA高压组中部分抗体出现背景染色，如PR、CD68、CD3、S-100、GST-π、p120、Calponin、CD99、EGFR、Lysozyme、Catenin-β、Glypican-3。其它组背景相对比较干净(图2)。

2.3 组织学形态比较实验结果显示，高压组中部分组织出现局部脱片(图3)、皱褶(图4)等现象，其它组暂未发现脱片、皱褶等现象。

3 讨论

目前，常用的抗原修复方式：热修复、酶修复。常用抗原修复液：EDTA、柠檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等[2]。随着一抗制备技术的发展，必须使用胰酶和胃酶修复的抗体逐渐被热抗原修复的抗体取代[3]。为便于操作，越来越多的病理技术人员将一抗采用“一锅煮”的方式进行抗原修复，而不再采用多种抗原修复液分开进行抗原修复[4]。

不同种类修复液的整体修复效果趋势为pH 6.0～9.0范围内，抗原修复液pH值越高，免疫组化染色结果越强[5]；采用低pH值的抗原修复液，免疫组化染色背景较干净，细胞形态较好[6]。采用相同的抗原修复液，其它条件相同的情况下，抗原修复温度越高，免疫组化染色结果越强[7]。本实验结果中微波组、水煮组、高压组、仪器组最高抗原修复温度分别为89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，所获得免疫组化染色强度与抗原修复温度呈正相关。目前，国内免疫组化试剂公司地址均为非高海拔地区，其质控的抗原修复为正常方式。高海拔地区受海拔影响，采用非高压方式进行抗原修复时，抗原修复温度会偏低，抗原决定簇暴露不充分[8]。若其它免疫组化染色条件，如试剂孵育采用试剂公司推荐的条件，免疫组化染色结果可能会整体偏弱[9]。当某些组织中某种抗原含量较低，或某种抗体的亲和力或敏感性较低时，可能造成假阴性结果[10]。本实验也验证了该结果，核表达的抗体对抗原修复温度要求较高，抗原修复温度较低时，亲和力和敏感性较低的核表达抗体出现假阴性的概率较大，如BCL-6、ERCC1、WT1、TDT、Rb Gene、PMS2、MLH1等。

综上所述，抗原修复方法是否恰当，直接影响免疫组化抗体的表达效果。对于高海拔地区，建议采用以下方法避免免疫组化假阴性：(1)选择EDTA高压1～2 min进行抗原修复；(2)加强一抗孵育条件，如延长一抗孵育时间或提高一抗孵育温度至37 ℃；(3)采用浓缩型试剂的病理科，可根据预实验结果适当提高一抗浓度；(4)采用具有低压加热功能的全自动免疫组化染色仪。