甲醛固定石蜡包埋切片经特殊染色后荧光定量聚合酶链反应检测的再利用

魏 雪，叶胜兵，章如松，夏秋媛，饶 秋，马恒辉，吴 楠

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的特异性炎症，在甲醛固定石蜡包埋组织切片中查见MTB是确诊结核的“金标准”。目前，结核病诊断的主要辅助检测方法是特殊染色和qRT-PCR检测。在临床病理诊断中，部分结核病患者由于获取标本困难，穿刺标本微小，病理组织多被用于HE染色、特殊染色，所剩组织太少无法进行相关分子检测。在全载玻片成像扫描技术应用下，将病理切片实现全数字化，形成数字切片，保存现有病理图像的同时，再利用特殊染色过切片进行qRT-PCR检测的可行性分析在国内鲜有报道。本实验通过对结核病患者组织切片经特殊染色后应用qRT-PCR检测，比较特殊染色处理前、后qRT-PCR检测结果的符合率，以期探讨标本回收利用的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年1月～2020年1月东部战区总医院临床送检诊断为结核标本30例，其中穿刺活检标本10例，手术切除标本20例；肺组织23例，肺外组织7例，病变部位主要为肺、肝、肾脏等；男性23例，女性7例；年龄20～58岁，平均(39.0±19.0)岁。所有组织标本纳入标准为肿瘤细胞含量≥20%[1]，均行特殊染色及qRT-PCR检测。

1.2 组织处理及方法标本均采用10%中性福尔马林进行固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片7张，分别用于HE染色、特殊染色和qRT-PCR检测。大组织标本每张切片至少切取2张蜡片，小组织标本每张切片上至少切取3张蜡片。抽取其中3张切片作为实验组先进行特殊染色再行qRT-PCR检测，剩余3张切片纳入对照组单独进行qRT-PCR检测。

1.3 特殊染色采用PAS染色、PASM染色和抗酸染色，具体实验方法参考《临床技术操作规范·病理学分册》中的染色方法进行[2]。

1.4 qRT-PCR检测实验组切片浸入二甲苯中直至盖玻片自然脱落，无水乙醇漂洗，风干后刮片收集组织；对照组切片直接浸入二甲苯脱蜡，无水乙醇漂洗，风干后刮片收集组织。操作严格按Qlamp DNA FFPE Tissue Kit操作说明书进行，收集样本DNA，后续步骤按MTB检测试剂盒说明书进行。

1.5 结果判定(1)PAS染色真菌呈紫色，细胞核呈蓝色。PASM染色真菌呈黑色，细胞核呈蓝色。抗酸染色MTB呈亮红色，表现为细杆状/短样状、菌体清晰、不折光，或者为稍弯的念珠样细杆状物，常可见黑色的着丝点，位于MTB的一端或其他部位，与组织切片位于同一水平面上[3]。非MTB及其他成分呈淡蓝色或亮红色，有折光性，背景染色呈淡蓝色。(2)qRT-PCR检测按MTB核酸检测试剂盒产品说明书进行，检测样本Ct值≥27和无数值时，判断为阴性；检测样本Ct值<27时，判断为阳性。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用Kappa一致性检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

30例结核标本组织学形态表现为上皮样肉芽肿性病变(图1)。抗酸染色MTB呈亮红色细杆状、菌体清晰、不折光，背景染色呈淡蓝色(图2)。qRT-PCR检测实验组MTB阳性11例(36.7%)，阴性19例(63.3%)。对照组MTB阳性11例，另外19例同样检测阴性。实验组和对照组检测结果符合率一致，Kappa系数为1.000(P<0.001，表1，图3)。

图1 肉芽肿性炎伴坏死 图2 MTB呈亮红色细丝状，抗酸染色

图3 A.实验组扩增曲线Ct值小于27.0，检测结果为阳性；B.对照组扩增曲线Ct值小于27.0，检测结果为阳性；红色为阳性对照，绿色为阴性对照，蓝色为检测标本

表1 qRT-PCR检测MTB

3 讨论

常用的结核病原学主要检测项目为特殊染色和qRT-PCR检测。PAS、PASM染色阳性结果显示荚膜结构，提示是否存在新型隐球菌、球孢子菌、曲菌病及皮肤真菌感染等。抗酸染色法检测MTB，可有效结合组织形态学进行定位观察，具有操作简单、直观准确、特异性高的优点，但其灵敏度略低。抗酸染色阳性结果既可能是MTB，也可能是非MTB或者麻风杆菌等，故需要应用其它检测手段。qRT-PCR检测直接测定MTB的DNA，WHO推荐其为结核诊断的最佳检测方法，选择相对保守的病原体核酸片段进行PCR扩增与荧光信号收集，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的优点，检出率高于抗酸染色，具有较高的诊断价值[4-5]。无论是哪一类检测方法，均不可避免出现假阴性，由于存在石蜡杂质，抑制试剂反应，故在检测过程中应严格按照试剂盒说明书要求，尽量减少误差，避免交叉污染。总之，在常规工作中客观看待两种检测方法各自的局限性，让两者恰如其分地辅助结核病的诊断，并结合患者的病史、临床症状及影像学资料，有效地提高结核病病理诊断的准确性。

MTB可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多组织器官的结核病，其中以肺部最为常见。本组中肺结核占大部分，尤其是肺穿刺组织标本，其穿刺标本较微小，前期的常规检测使蜡块上的组织已所剩无几，难以再行切片；或者部分会诊患者带来的白片数量有限，而无法在短时间内重新获得切片，都使得qRT-PCR检测无法进行，无法明确患者的病理诊断结果，延误诊治。本组着重探讨标本回收利用的新方法，有效利用仅存的切片进行后续辅助检查。将病理切片图像信息通过全玻片成像扫描技术形成数字切片，保存现有病理图像的同时，再利用特殊染色过的切片进行分子检测，满足病理诊断需求。

特殊染色是将组织细胞中的待检测物质直接与染料结合而被染上颜色，从而显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等。qRT-PCR检测是针对MTB特异性设计相应的引物和探针，应用PCR法体外扩增，通过荧光信号的变化测定DNA，从而特异性诊断MTB。特殊染色及qRT-PCR检测无论是从检测对象、检测步骤、所用试剂等均不相同，不会互相干预影响组织切片的检测结果，理论上经过特殊染色过的切片再进行qRT-PCR检测是可行的。此次实验也证实了这一理论，特殊染色前、后qRT-PCR检测结果具有高度的一致性，利用特殊染色后的切片可以满足分子病理检测的需求。

随着肿瘤研究角度和研究方法的不断更新，肿瘤靶点的个体化分子检测越来越受到临床重视，组织标本的珍贵性显而易见。实验已经证明，组织切片经特殊染色后能够进行qRT-PCR检测，不仅节省了标本的使用量，更减少了患者二次取材的可能性，为临床实验项目更全面的开展提供一定帮助，是值得推广的技术新方法。