CKpan免疫组化与弹力纤维双重染色在结直肠癌静脉侵犯中的应用价值

2022-03-22 14:09杜晓华胡玉莹罗碧怡郑广娟杨海峰
临床与实验病理学杂志 2022年2期
关键词:弹力双重切片

杜晓华,胡玉莹,李 雪,2,罗碧怡,郑广娟,杨海峰

2018年中国癌症统计报告显示:我国结直肠癌的发病率、病死率在恶性肿瘤中分别位居第3位、第5位,其中新发病例37.6万,死亡病例19.1万[1]。肿瘤血管侵犯(vascular invision, VI)是结直肠癌术后病理分期(pTNM)及临床个体化治疗的重要指标,是结直肠癌Ⅰ类预后因子,同时也是评估肿瘤远处转移、预后以及疗效预测的重要指标[2]。VI分为淋巴管侵犯和静脉侵犯两类,在实际临床病理工作中,通常用HE染色在显微镜下观察是否有VI,但易造成静脉侵犯的误、漏诊,导致检出率偏低及各单位之间检出率差异较大。近年有研究认为,弹力纤维染色能帮助识别静脉侵犯,提高静脉侵犯诊断的阳性率。本文采用CKpan免疫组化染色联合弹力纤维染色(双重染色),使两者相互结合检测肿瘤细胞与血管的位置,以期更直观的展现肿瘤静脉侵犯的证据,提高结直肠癌的静脉侵犯检出率。

1 材料与方法

1.1 标本收集2020年4~5月广东省中医院结直肠癌组织学标本60例,患者术前均未接受放、化疗等辅助治疗,术后经组织病理学检查明确诊断。其中男性30例,女性30例;年龄24~85岁,平均(64.8±14.1)岁;pT2期9例,pT3期25例,pT4a期26例;伴淋巴结转移者25例。

1.2 方法

1.2.1HE染色检测 标本均经10%中性福尔马林固定,常规脱水及石蜡包埋,4 μm厚连续切片,常规HE染色,光镜下观察。

1.2.2弹力纤维染色检测 地衣红乙醇液,将地衣红溶于70%乙醇,再加入浓盐酸,放置1~2天后即可。组织经10%中性福尔马林固定,常规脱水包埋;切片脱蜡至70%乙醇;加入地衣红乙醇液浸染3 h;70%乙醇液浸洗2次,每次约0.5 min,至染液不脱出为止;95%乙醇、无水乙醇脱水;二甲苯透明,中性树胶封固。

1.2.3双重染色检测 肿瘤组织蜡块,4 μm厚连续切片,行免疫组化EnVision两步法染色。抗体CKpan购自珠海泉晖公司,应用罗氏全自动免疫组化仪进行自动加样,镜下观察染色结果可靠,再进行弹力纤维特殊染色(具体步骤参考上述弹力纤维染色)。以肺动脉血管为外对照,结直肠癌组织周边血管中的弹力纤维组织以及脏层腹膜的弹力纤维组织为内对照。

1.3 结果判读60例结直肠癌组织均行HE染色、单一弹力纤维染色及双重染色(CKpan免疫组化联合弹力纤维双重染色)。各组病例均由广东省中医院2名资深的病理医师进行判读及测评,观察到肿瘤静脉侵犯为阳性,未观察到或不确定肿瘤静脉侵犯为阴性,记录3种方法的阳性例数和阴性例数。

2 结果

2.1 HE染色在常规HE染色切片,部分病例显微镜下见灶性分布的癌细胞,周边可见厚壁动脉血管,而与之伴行的静脉血管无法辨识,HE染色切片无法明确是否有肿瘤静脉侵犯(图1)。部分病例显微镜下见可疑血管壁内的片状坏死组织,其内可疑低分化的肿瘤细胞,HE染色切片无法明确有无静脉侵犯(图2)。

图1 难以辨认静脉形态,无法确定有无肿瘤静脉侵犯,HE染色 图2 可疑血管壁内可见片状坏死及出血,其内见可疑低分化的肿瘤细胞,无法明确血管和肿瘤细胞,HE染色 图3 可清晰勾勒出血管的弹力层呈砖红色波浪状,弹力纤维染色 图4 可见棕褐色的肿瘤细胞团,CKpan呈阳性,EnVision两步法 图5 可清晰显示肿瘤与血管的关系,证实肿瘤侵犯血管,CKpan免疫组化联合弹力纤维双重染色 图6 同时显示低分化肿瘤细胞和被破坏的血管壁,证实肿瘤侵犯血管,CKpan免疫组化联合弹力纤维双重染色

2.2 弹力纤维染色在弹力纤维染色切片,动静脉壁的弹力纤维呈砖红色波浪状着色(图3),可显示动脉及伴随的静脉,静脉管壁内及其弹力纤维层内可见肿瘤细胞,证实为静脉侵犯。

2.3 免疫组化染色CKpan在结直肠癌细胞的胞质中呈棕褐色(图4),未见明确的静脉管壁,不能证实是否有静脉侵犯。

2.4 双重染色双重染色切片中CKpan免疫组化呈棕褐色胞质着色,能够清晰地显示肿瘤细胞,弹力纤维染色呈砖红色显示波浪状的血管壁,其不但能显示血管壁弹力纤维的缺失和排列紊乱,还能观察到多数厚壁血管弹力纤维增生和血管壁重构,以及CKpan阳性的肿瘤细胞早期浸润血管壁的现象(图5)。对可疑血管壁内少量怀疑的细胞团,双重染色切片不仅勾勒出血管壁轮廓,其内的低分化肿瘤细胞亦能清晰显示,可证实有静脉侵犯(图6)。

2.5 VI检出率对比经统计结果显示,HE染色VI检出率为26.7%,单一弹力纤维染色VI阳性率为41.7%,而双重染色VI阳性率为63.3%,三组比较差异有统计学意义(P<0.01,表1)。

表1 HE、弹力纤维染色及双重染色切片各静脉侵犯的检出率[n(%)]

3 讨论

根据结直肠癌AJCC指南,肿瘤VI是独立于Dukes分期及pTNM分期而影响患者预后的重要检测指标[3],VI是Ⅱ期结直肠癌患者接受辅助化疗的高危因素之一,也是其复发和预后的独立影响因素[4]。脉管侵犯的类型可进一步细分为淋巴管侵犯和静脉侵犯[3],静脉侵犯又被称为“大血管”侵犯(“large vessel” invasion),已有研究表明其是结直肠癌血道转移和生存的独立预后因素。因此,准确识别结直肠癌手术标本中的静脉侵犯对临床后续治疗决策和预后评估具有重要价值[5]。然而,已有研究结果表明,不同研究中心的静脉侵犯报告率存在较大差异,并认为是否使用特殊染色辅助判断也是导致差异的原因之一[5]。弹力纤维广泛存在于血管壁,尤其是大血管的管壁,因此可以通过弹力纤维染色判断肿瘤是否侵犯血管。国外Kirsch等[5]对40例结直肠癌的HE染色切片进行弹力纤维染色,发现弹力纤维染色切片对肿瘤静脉侵犯的准确率比常规HE染色高2倍(46.4%vs19.6%,P=0.001)。Howlett等[6]对92例结直肠癌术后HE染色切片未发现肿瘤血管受侵的标本开展弹力纤维染色,其结果显示其中41例(44.0%)切片可观察到肿瘤静脉侵犯,弹力纤维染色的识别率明显提高,且只需1张弹力纤维染色切片即可评估。国内于雪姣等[7]研究结果显示,常规HE染色的静脉侵犯检出率为32.0%,而弹力纤维染色为66.7%,后者的敏感性为65.8%,而特异性高达100.0%。以上研究提示弹力纤维染色在结直肠癌静脉侵犯中的良好效果及实践意义。雷光等[8]报道在弹力纤维染色切片上对肿瘤细胞的显示低于常规HE染色的清晰度,在仅有少量肿瘤细胞侵犯弹力纤维膜或分化差的癌,以及伴肿瘤坏死及组织细胞集聚等情况,弹力纤维染色判读受到影响。同时,弹力纤维染色的识别率数据报道不一致。可能存在以下原因:(1)标本取材蜡块较少,有些病例血管弹力纤维层完全破坏,无法显示着色;(2)技术人员操作的原因,未能严格按特殊染色操作要求,导致弹力纤维染色效果欠佳;(3)各医院使用的弹力纤维染色的配制试剂和颜色显示方法不统一,敏感性有差异[8],且炎症和肿瘤均可导致弹力纤维的不连续表现,使判断肿瘤侵犯血管弹力层的难度增加。

目前,弹力纤维染色与免疫组化双重染色在心血管系统及肺癌的胸膜浸润情况,以及许多肿瘤血管内癌栓的诊断中已有较多报道[9-10],但关于结直肠癌血管壁的肿瘤细胞浸润情况报道较少。本实验双重染色切片的静脉侵犯阳性率为63.3%,与单一弹力纤维染色的41.7%相比,差异有显著性。因此,我们认为双重染色切片对结直肠癌静脉侵犯的检出有独特的优势,同时可弥补上述原因的不足,主要优势表现在以下几点:(1)染色对比清楚,定位准确,易于判读。为了准确识别肿瘤静脉侵犯,必须掌握肿瘤组织学结构、肿瘤细胞排列形式、肿瘤细胞形态及肿瘤细胞与间质的关系,周边动脉及静脉的结构及走向,尤其是分化差的癌及血管壁破坏的病例,在HE形态学上鉴别困难,而双重染色切片中肿瘤细胞质呈棕褐色,血管的弹力纤维呈砖红色,对比明显。部分病例可见肿瘤细胞对邻近的弹力纤维进行“蚕食”,同时能观察到少量肿瘤细胞浸润至血管的弹力纤维层内,这种微小的改变难以用单一弹力纤维染色发现。双重染色切片可直接观察与肿瘤细胞相邻的血管弹力纤维变化,且能突显肿瘤对弹力纤维的促增生及侵袭能力。(2)减少操作步骤,节约阅片时间。独立染色方案需经常切换HE及弹力纤维染色的切片进行定位,特别是少量肿瘤细胞在弹力纤维明显增生的背景下,可能发生遗漏的风险。(3)排除干扰,提高准确性。对于肿瘤组织坏死后发生退变、少量脱落的肿瘤细胞或低分化癌等情况,在HE染色与独立弹力纤维染色中难以与组织细胞鉴别,双重染色在此类病变应用中优势更加明显,也有效避免血管内皮细胞或纤维母细胞增生等假阳性情况。(4)减少技术人员工作量,一张双重染色切片即可明确肿瘤细胞与血管弹力纤维层的关系,减少了切片数量,也相应减少了组织损耗和蜡块数量,节约肿瘤组织储存空间。

双重染色优势突出,但在应用上依然存在其局限性,主要表现为CKpan阴性病例。不适用本方法的病例包括:极少见的未分化癌、肉瘤、神经内分泌癌等。这部分病例诊断可加做免疫组化低分子量CK8/18或神经内分泌染色与弹力纤维双重染色法。对位于黏膜内或黏膜下层的肿瘤,该区域主要是小血管或淋巴管,缺乏大血管的弹力纤维层,可使用血管标记如CD34、CD31或淋巴管标记如D2-40染色等,进行脉管侵犯的判读。

综上所述,本实验结果显示双重染色切片能清楚显示肿瘤细胞与血管纤维层的关系,其结合了单一免疫组化和弹力纤维染色的优点,可同步显示血管及肿瘤细胞,能更好的观察肿瘤细胞与血管的毗邻关系,可以显著提高静脉侵犯的检出率。VI阳性肿瘤患者提示预后不良,双重染色切片可为结直肠癌分期及预后提供更准确及更有价值的参考,对明确病理诊断及制定临床治疗方案具有积极意义。

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