布鲁氏菌病不同初筛方法及诊断试剂检测差异性分析

刘丽娅，叶 锋，马晓菁，谷文喜，谢彩云，钟 旗，易新萍

(新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830000)

0 引 言

【研究意义】布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种慢性人畜共患传染病[1]。家畜感染布病可引起母畜流产、胎衣不下和子宫内膜炎，公畜则出现睾丸炎、附睾炎[2]。布病对家畜繁殖和生产性能造成严重危害，头胎流产率高达50%～80%，奶和肉减产15%～20%[3]。近年来，随着养殖业的发展，饲养量的增加，牲畜及其产品调运愈发频繁，牛布病在一些地区呈逐年上升趋势[4]。简便、快捷、准确度高的诊断方法及检测产品是有效开展牛布病防控工作的基础。 【前人研究进展】 目前布病诊断方法主要包括细菌学、血清学和分子生物学诊断3方面，其中血清学诊断方法因其操作简便、生物风险小，应用最为广泛[5]。已有多篇报道通过应用不同布病血清学检测方法，对牛、羊血清检测结果进行比对分析[6-11]。【本研究切入点】研究从布病不同血清学初筛方法角度出发，结合不同厂家试剂因素，较全面地对布病初筛方法检测数据进行了差异性分析。【拟解决的关键问题】 采用布病4种常规的血清学初筛检测方法，虎红平板凝集试验(RBT)、酶联免疫吸附试验(iELISA)、荧光偏振试验(FPA)和免疫胶体金检测方法(GICA)，选择在市面上销售、具有正规生产批文批号的不同厂家商品化试剂或试剂盒，对确定的阴、阳性牛、羊血清样品进行检测。对布病初筛各方法及各厂家试剂产品进行初步分析，以期为布病临床诊断方法选择及试剂的选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集

在新疆地区采集的135份牛血清样品，72份羊血清样品。应用英国参考实验室APHA竞争性ELISA(cELISA)试剂盒，对实验室近年来采集的135份牛血清样品进行检测，78份阳性、57份阴性；羊血清72份，检测结果为52份阳性、20份阴性。

1.1.2 诊断试剂

阴、阳性对照血清购自哈药集团生物疫苗有限公司；英国参考实验室APHA竞争性ELISA试剂盒，批号为C223-17；RBT试剂2种：英国参考实验室布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原(Ⅰ)、北京某所布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原(2017810)(Ⅱ)；FPA试剂1种：哈尔滨某公司布鲁氏菌病荧光偏振测定法试管型抗体检测试剂盒(921012-1)(Ⅲ)；胶体金试剂4种：深圳某公司布鲁氏菌病抗体快速检测卡(2018041212)(A)、兰州某公司布鲁氏菌抗体检测试剂盒(胶体金法)(20170501)(B)、浙江某公司布鲁氏菌抗体金标快速检测卡(BRU180303)(C)、上海某公司一步法胶体金快速检测卡(G180319302)(D)；iELISA试剂4种：北京某公司布病间接ELISA抗体检测试剂盒(P04130-2)(a)、浙江某公司牛布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测试剂盒(01117)(b)、某所牛布病间接ELISA抗体检测试剂盒(17111506)(c)、北京某公司牛布鲁氏杆菌抗体检测试剂盒(20170502G)(d)。所有试剂及试剂盒均在有效期内。

1.2 方 法

1.2.1 血清样本检测和结果判定

所有方法均严格按照国标GB/T18646-2018 的规定和试剂盒说明书进行操作及结果判定。

1.2.2 血清样本检测和结果判定

应用英国参考实验室APHA竞争性ELISA(cELISA)试剂盒，对采集的207份血清样本进行检测，以此结果为确诊标准开展检测差异性研究。

1.2.3 检测结果差异性

计算敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率、一致率、一致性系数(Kappa)，敏感性Se=a/(a+c)，特异性Sp=d/(b+d)，假阳性率=b/(b+d)，假阴性率=c/(a+c)、一致率= [(a+d)/n]×100%、Kappa值=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)[12-13]。

假阴性率是指确诊阳性用某种方法检测为阴性与确诊方法检测所有阳性之和的百分比；假阳性率是指确诊为阴性用某种方法检测为阳性与确诊方法检测所有阴性之和的百分比；一致率是指确诊的阳性与阴性样本且与2种检测方法结果相一致的总和与所有检测样本的百分比。Kappa值是医学上常用于计数资料的一致性评测。假阴性与假阳性可反映检测方法的敏感性和特异性，一致率是检测方法的相关程度，Kappa值是一致性检验的统计指标，计算比较其符合程度[6]。Kappa值为0.81～1.00 时，判定2种方法完全符合；为0.61～0.80 时，判定2种方法高度符合；为0.41～0.60 时，判定2种方法中度符合；为0.21～0.40 时，判定2种方法比较符合；0.20 以下为轻度符合；0 以下为不符合。表1

表 1 敏感性、特异性及一致性系数试验[12-14]Table 1 Sensitivity、 specificity and consistency coefficient test

2 结果与分析

2.1 牛、羊血清的确诊

研究表明，确定布鲁氏菌病阳性牛血清78份、阴性57份，布鲁氏菌病阳性羊血清52份、阴性20份。

2.2 布鲁氏菌病RBT方法检测差异性

结果表明，牛血清Ⅰ、Ⅱ抗原检测特异性均为100%，其中Ⅱ抗原敏感性较高为96%，假阴性率较低为3.85%，一致率较高为97.78%。2种抗原与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值显示为完全符合。

羊Ⅰ、Ⅱ抗原检测特异性均为100%，Ⅱ抗原敏感性较高为91%，假阴性率较低为9.09%，一致率较高为94.44%，Ⅱ抗原与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值显示为完全符合，Ⅰ抗原与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值显示为高度符合。表2

表2 布病RBT方法检测结果差异性比较Table 2 Comparison of differences in detection results of RBT method

2.2.1 布鲁氏菌病FPA方法检测差异性

研究表明，检测牛、羊血清敏感性均为100%，检测牛血清的特异性较高为75.44%，假阳性率较低为24.56%，一致率较高为89.63%之间。牛、羊血清检测与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值显示均为高度符合。表3

表3 布病FPA方法检测结果差异性比较Table 3 Comparison of differences in FPA detection results

2.2.2 布鲁氏菌病GICA方法检测差异性

研究表明，敏感性A、C、D均为100%，B为42%；特异性B为100%，其次A为85.96%、C为57.89%，D最低为54.39%；假阳性率B为0，其次A为14.04%、C为42.11%，D最高为45.61%；假阴性率A、C、D均为0，B最高为57.69%；一致率A最高为94.07%，其次C为82.22%、D为80.74%，B最低为66.67%；A与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值判定为完全符合，C为高度符合，D为中度符合，B为比较符合。

敏感性C、D均为100%，A为95.45%，B最低为54.55%；特异性A、B为100%，C、D为71.43%；假阳性率A、B为0，C、D为28.57%；假阴性率C、D均为0，A为4.55%，B最高为45.45%；一致率A最高为97.22%，其次C、D为88.89%，B最低为72.22%；A与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值判定为完全符合，C、D为高度符合，B为中度符合。表4

表4 不同胶体金试纸条布病检测结果差异性比较Table 4 Comparison of differences in detection results of different colloidal gold test strips

2.2.3 布鲁氏菌病iELISA方法检测差异性

研究表明，a、b、c、d敏感性均为100%；特异性a、c为59.65%，其次d为54.39%，最低b为31.58%；假阳性率a、c最低为40.35%，其次d为45.61%，最高b为68.42%；B为0，其次A为14.04%、C为42.11%，D最高为45.61%；假阴性率a、b、c、d均为0；一致率a、c为82.96%，其次d为80.74%，最低b为71.11%；a、c与英国参考实验室cELISA试剂盒的Kappa值判定为高度符合，d为中度符合，b为比较符合。。图1，图2，表5

图1 牛血清不同方法及不同厂家试剂布病检测结果差异对比Fig.1 Comparison of different methods and different manufacturers' reagents

表5 不同iELISA试剂盒布病检测结果差异性比较Table 5 Comparison of differences in detection results of different iELISA kits

图2 羊血清不同方法及不同厂家试剂布病检测结果差异对比Fig.2 Comparison of different methods and different manufacturers' reagents

3 讨 论

布病的准确检疫和快速诊断是预防和控制布病的关键环节。根据国标 GB/T 18646-2018 规定，布病虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病监测及泌乳母牛布病诊断的初筛试验，OIE 推荐的间接ELISA和荧光偏振试验也常被用于布病初筛[15]。研究选择4种布病初筛方法(RBT、FPA、GICA和iELISA)、11种试剂检测同批牛血清结果进行分析发现，在敏感性方面，除胶体金试纸条(B)敏感性为最低42%外，其余试剂都具有较高的敏感性，其中8种试剂检测敏感性高达100%；不同方法及其不同产品试剂检测特异性差异较为显著，最高可达100%，最低仅为32%。应用3种布病初筛方法(RBT、FPA和GICA)、7种试剂检测同批羊血清结果表明，敏感性最高达100%，最低为55%，特异性最高达100%，最低为71%。从阴、阳性样品检出一致率结果来看，RBT方法一致率最高，其次为FPA、GICA、iELISA。与英国参考实验室cELISA检测方法间的Kappa值结果显示，RBT、FPA与其完全或高度符合，GICA和iELISA为中度符合。

iELISA具有较好的敏感性，和有些研究报道一致[16]。RBT有较好的特异性，这和杨书观等[17]用3种布鲁氏菌病试验方法对380例布鲁氏菌病结果进行检测比较分析结果略有不同。检测人的诊断抗原和兽用抗原或许存在有区别，也可能与本研究选择抗原不够全面有关。对比同种方法不同试剂检测结果发现，RBT方法2种抗原都具有较好的特异性，但敏感性Ⅱ抗原优于Ⅰ抗原；GICA 4种试纸条检测差异较为显著，A最佳，B最差。iELISA 4种试剂盒检测结果敏感性都较好，但特异性最高为60%，最低为32%，a、c试剂盒优于其他2种。

4 结 论

RBT和GICA较具优势，FPA和 iELISA 方法操作相对繁琐，需仪器设备读值，采用不同方法、不同试剂结果间存有差异；应用同一方法，采用不同试剂对同批血清进行检测，结果也存有较大差异；运用同一厂家试剂，检测牛、羊血清，敏感及特异性效果也有不同。布病检测一定要选择2种或以上的检测方法联合检测以达到其准确性，并应先选择敏感性较好、快速易操作的方法进行初筛，后用敏感性、特异性均好的检测方法进行复检，RBT方法Ⅱ抗原优于Ⅰ抗原；GICA 4种试纸条差异较为显著，A最佳，B最差；iELISA试剂盒a、c优于其他b、d。