青霉菌对秸秆复合菌系好氧发酵的影响

赵玉鑫，张铁，，赵玉晓，华栋梁，于合龙

（1.吉林建筑大学市政与环境工程学院，吉林 长春 130118；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）能源研究所，山东省生物质气化技术重点实验室，山东 济南 250014；3.吉林农业大学信息技术学院，吉林 长春130118）

0 引言

作为农业大国，我国的农作物秸秆资源极其丰富，年产量接近109t，其中玉米秸秆占42%[1]，[2]。因此，挖掘高效的分解秸秆的微生物资源、开发相应的秸秆生物处理和资源化利用技术是我国农业废弃物资源化利用急需解决的问题[3]。好氧发酵是秸秆减量化和资源化的重要方法，通过好氧发酵可使秸秆中的木质纤维素得到有效降解，同时生成腐殖质。好氧发酵所得产物中含有大量的营养物质与腐殖质，可作为农林作物肥料和土壤调理剂。但是，秸秆中木质素、半纤维素和纤维素形成的三维空间交联结构，限制了半纤维素和纤维素等有机质的生物转化[4]，[5]。近年来，有关秸秆好氧发酵的研究主要集中于添加外源微生物提高秸秆好氧发酵的腐熟效果。何宙阳在玉米秸秆好氧发酵过程中添加米黑根毛霉菌和芽孢杆菌组成的复合菌系，显著提高了发酵产物的总养分与种子发芽率[6]。李雯将纤维素降解菌剂和纤维素降解酶制剂同时添加到玉米秸秆中进行好氧发酵，结果显示，玉米秸秆堆肥的碳、氮损失明显降低，物料养分转化有所提高，玉米秸秆提前18 d达到腐熟标准[7]。杨梦雅向玉米秸秆中添加低温木质纤维素分解复合菌系，使得秸秆降解率提高到了43.65%[8]。Saritha M采用灰色链霉菌（Streptomyces griseus）对农业废弃物进行好氧处理，使得木质素去除率可达11.6%～22.4%[9]。张秧将由枯草芽孢杆菌、米根霉、毕赤酵母菌和戊糖片球菌等组成的复合菌系接种于小麦秸秆中进行好氧堆肥，结果显示，复合菌系显著促进了有机物的降解，使得小麦秸秆的降解率可达24.48%[10]。

青霉菌是一种重要的木质纤维素降解菌，目前，有关青霉菌降解木质纤维素的研究主要集中于青霉菌合成漆酶和木质素过氧化物酶等木质素降解酶的机理与条件优化。在工程实际应用中，秸秆好氧发酵往往是在复杂菌群的共同作用下进行的，而对于青霉菌与其他微生物在秸秆好氧发酵过程中的相互作用，鲜有研究。因此，本文主要研究青霉菌对玉米秸秆复合菌系好氧发酵的影响以及青霉菌与其他微生物间的相互作用，为提高青霉菌在实际秸秆好氧发酵工程中的应用提供理论指导与科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆来自山东省济南市章丘区某农田，经自然风干后备用，使用前破碎成长1～2 cm，宽2 cm的碎片，并高温灭菌30 min。风干后玉米秸秆的含水率为7.46%，总有机碳含量为430 g/kg，全氮含量为11.2 g/kg，C/N为38.39。

好氧发酵处理所用的复合菌系为山东贝佳生物科技有限公司生产的液体有机肥发酵剂，该复合菌剂每毫升的有效活菌数≥1×1010个，具体的微生物组成如表1所示。

表1 复合菌剂的微生物组成Table 1 Composition of microorganism in compound bacterium agent

本文所用的青霉菌由华中农业大学提供，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015757。培养基为PDA液体培养基（200 g马铃薯切碎煮沸15 min，用纱布过滤，将20 g葡萄糖加入滤液中，加入1 000 mL蒸馏水，121℃下灭菌30 min）。

1.2 试验方法

1.2.1 青霉菌扩大培养

吸取2 mL青霉菌孢子悬液接种于400 mL的PDA培养液中，置于恒温30℃，转速为180 r/min的振荡培养箱中培养7 d，然后离心（4℃，3 500 r/min）20 min，去除上清液；沉淀物经蒸馏水反复冲洗后加入500 mL蒸馏水定容，青霉菌菌液浓度为1×107CPU/mL。

1.2.2 试验设计

向6个容积为1 L的锥形瓶中分别加入35 g破碎后的玉米秸秆和10 mL的复合菌系，添加0.36 g尿素调节C/N为25，对照组（CK）不添加青霉菌，另外5组分别按秸秆干重的0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%加入青霉菌悬液（分别记为V1，V2，V3，V4和V5）。各试验组均在恒温30℃的培养箱中静态发酵15 d，并在第2，4，6，8，10，12，15天采集样品进行检测分析，每个试验组设置3个平行。

1.3 分析方法

1.3.1 秸秆降解率的测定

采用减重法测定秸秆降解率RW，RW的计算式为

式中：W0为秸秆初始质量，g；Wn为秸秆降解n天后的质量，g。

1.3.2 木质纤维素含量及降解率的测定

将干燥后的样品粉碎后过筛，称取1 g左右20～30目的样品，用ANKOMA200 i型纤维分析仪测定纤维素、半纤维素和木质素的含量及降解率[11]。

1.3.3 漆酶、木质素过氧化物酶、木聚糖酶和纤维素酶的活性测定

对比三代金融危机理论可以发现：三种理论都是建立在商品经济的基础上，只是各自的侧重点不一样。第一代金融危机主要侧重于经济的基本面和宏观经济的表现；第二代金融危机比较侧重危机的消极影响和公众对经济环境的信心崩塌；而第三代金融危机则是将侧重点放在了私人部门和脆弱的金融体系上。

参考文献[12]中的方法提取粗酶液，即取4 g样品浸入16 mL蒸馏水，4℃静置24 h，纱布过滤，滤液离心（4℃，8 000 r/min）10 min，取上清液；然后通过试剂盒法分别测定漆酶、木质素过氧化物酶、木聚糖酶和纤维素酶的活性。试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3.4 腐殖酸含量的测定

通过腐殖酸组成修改法测定样品的腐殖酸含量。采用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的Na4P2O7（体积比为1：1）对样品进行浸提，取一定量浸提液用K2Cr2O7容量法测定含碳量，即总腐殖酸含量（以碳含量计）；其余浸提液采用6 mol/L的HCl溶液酸化至pH=1，充分搅拌，室温下静置过夜，再离心（5 000 r/min）20 min，沉淀物溶解于0.1 mol/L的NaOH溶液，用K2Cr2O7容量法测定含碳量，即胡敏酸含量（以碳含量计）；富里酸含量为总腐殖酸含量减去胡敏酸含量[7]。

1.3.5 微生物群落结构分析

使用DNA提取试剂盒提取微生物的DNA，每次提取时重复3个平行样品试验，将试验取得的DNA进行混合获得最终代表性样品，分别对细菌和真菌进行16S rDNA和ITS扩增，并进行高通量测序。

2 结果与分析

2.1 青霉菌对玉米秸秆降解的影响

玉米秸秆降解率的变化情况如图1所示。

图1 玉米秸秆降解率的变化情况Fig.1 Changes of weightlessness rate in corn straw

从图1可以看出：秸秆降解率随着青霉菌添加量的增加而上升；前6 d的秸秆降解速率较低，V1，V2，V3，V4，V5组的秸秆降解率分别为3.51%，4.32%，5.86%，5.91%和6.22%，对照组的秸秆降解率为3.27%；在第6～12天，各组的秸秆降解速率显著加快，当好氧发酵结束时，V1，V2，V3，V4，V5组的秸秆降解率均超过50%，分别为50.73%，52.97%，60.52%，62.80%和64.10%，对照组的秸秆降解率为47.61%；当青霉菌的添加量超过0.3%时，秸秆降解率随青霉菌添加量的增加而升高的趋势不明显。

2.2 青霉菌对玉米秸秆中木质纤维素含量及降解率的影响

玉米秸秆中木质纤维素含量及降解率的变化情况如图2所示。从图2可以看出：各试验组的木质素含量均呈现出先减少后增加的变化趋势，好氧发酵结束后，对照组和V1，V2，V3，V4，V5组的木质素含量分别为21.08%，21.31%，20.92%，23.71%，23.10%，22.92%；各试验组的纤维素含量均呈现出持续上升的变化趋势，好氧发酵结束后，对照组和V1，V2，V3，V4，V5组的纤维素含量分别为34.34%，36.09%，38.35%，40.39%，41.39%，42.63%；各试验组的半纤维素含量除前4 d略有升高外，整体呈急剧下降得趋势，好氧发酵结束后，对照组和V1，V2，V3，V4，V5组的半纤维素含量分别为31.28%，29.30%，27.44%，22.60%，22.21%，21.16%。从图2还可以看出：好氧发酵前4 d，各试验组的木质素降解率均显著高于纤维素和半纤维素的降解率；随着好氧发酵的进行，纤维素和半纤维素的降解率逐渐增加，好氧发酵结束后，木质纤维素降解率的关系为半纤维素＞木质素＞纤维素；随着青霉菌添加量的增加，木质纤维素降解率呈上升趋势，但当青霉菌添加量超过0.3%后，木质纤维素降解率和青霉菌添加量为0.3%时没有显著差异。

图2 玉米秸秆中木质纤维素含量及降解率的变化情况Fig.2 Changes of content and degradation rate of Lignocellulosic in corn straw

造成以上结果的原因可能是多数木质纤维素降解菌为兼性降解微生物，可以同时降解木质素、纤维素和半纤维素，在好氧发酵前期，纤维素和半纤维素的降解速率低于木质素的降解速率，造成秸秆中的木质素含量下降，纤维素和半纤维素含量上升。随着好氧发酵时间的延长，木质纤维素降解屏障被打破，微生物对更容易被分解的纤维素和半纤维素的降解速率逐渐增加，从而导致秸秆中的木质素含量呈上升趋势。青霉菌可以合成木质素降解酶，也可以合成半纤维素和纤维素降解酶，添加青霉菌有利于提高秸秆中木质纤维素的降解率，但由于木质纤维素的降解过程是复合微生物共同作用的结果，同时青霉菌与其他微生物可能存在营养竞争关系，所以当青霉菌添加量大于0.3%后，单纯提高青霉菌添加量不能显著提高木质纤维素降解率。

2.3 青霉菌对木质纤维素降解酶活性的影响

好氧发酵过程中，木质纤维素降解酶的活性变化情况如图3所示。由图3可知：随着青霉菌添加量的增加，漆酶活性显著提高，在好氧发酵第10 d，对照组和V1，V2，V3，V4，V5组的漆酶活性分别为41.80，42.02，47.60，58.45，66.40，71.06 U/mg；木质素过氧化物酶活性的变化规律与漆酶相反，即随着青霉菌添加量的增加，木质素过氧化物酶活性呈降低趋势，在好氧发酵第10 d，对照组的木质素过氧化物酶活性最高，为8.24 U/mg；与半纤维素降解相关的木聚糖酶活性没有随着青霉菌添加量的改变而发生显著变化，在好氧发酵第10 d，各组的木聚糖酶活性均达到最高值，且均在9 U/mg以上。

图3 好氧发酵过程中，木质纤维素降解酶的活性变化情况Fig.3 Changes of lignocellulose degrading enzymes activity during aerobic fermentation

青霉菌产漆酶的效率较高，复合菌系中的芽孢杆菌产木质素过氧化物酶的效率较高，这可能是添加青霉菌可以显著提高漆酶活性，降低木质素过氧化物酶活性的主要原因。青霉菌的添加并没有对木聚糖酶的活性产生显著影响。青霉菌对秸秆降解的促进作用可能是由于添加青霉菌后提高了漆酶活性，从而提高了对木质纤维素降解屏障中木质素的破坏作用，为复合菌系中其他微生物降解转化半纤维素和纤维素提供了有利条件。

2.4 玉米秸秆中腐殖酸含量及胡富比的变化

腐殖酸含量是影响堆肥腐熟度及其农用效果的重要因素。总腐殖酸包括胡敏酸和富里酸，其中胡敏酸分子量大、稳定性高，对土壤修复有利；富里酸分子量小、活性较大、氧化程度较高。胡富比是胡敏酸碳的质量分数与富里酸碳的质量分数的比值，可以反映堆肥的腐熟化程度，其值越高，说明堆肥的氧化及芳构化程度越高，分子结构越复杂，堆肥越稳定[13]～[15]。好氧发酵末期，玉米秸秆中总腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比的变化情况如表2所示。

表2 好氧发酵末期，玉米秸秆中总腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比的变化情况Table 2 Changes of content of total humic acids，humic acid，fulvic acid and ratio of humic acid to fulvic acid in corn straw at the end of aerobic fermentation

由表2可知：除对照组外，各组的总腐殖酸含量均超过了400 g/kg，当青霉菌添加量为0.3%时，总腐殖酸含量达到最高，为521.75 g/kg。胡敏酸和富里酸含量及胡富比的变化趋势与总腐殖酸含量的变化趋势相同，且胡敏酸和富里酸含量及胡富比均在青霉菌添加量为0.3%时达到最高，最高值分别为331.64，190.11 g/kg和1.74。

造成以上结果的原因可能是随着降解时间的延长，木质纤维素被微生物分解转化为结构复杂的腐殖质类物质，有机物质被分解的同时，部分富里酸也被分解，新形成的富里酸被进一步缩合成结构复杂的胡敏酸，使得胡敏酸含量增加[14]。富里酸含量的变化受到矿化和腐殖化两者共同作用的影响，在好氧发酵末期，腐殖化作用明显强于矿化作用，富里酸因此不断累积。添加青霉菌能够增强腐殖化作用，进而增强胡敏酸和富里酸的转化效果，提高秸秆腐熟程度，但添加青霉菌也改变了微生物的群落结构，导致青霉菌添加量超过0.3%时，秸秆的腐熟程度反而降低。

2.5 微生物群落组成的变化

真菌在发酵物料的分解转化和腐熟稳定方面具有重要作用。好氧发酵末期，真菌在门和属水平的相对丰度如图4所示。从图4（a）可以看出，在好氧发酵末期，真菌群落在门水平主要为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。子囊菌门是降解木质纤维素的主导菌门，所以在整个降解过程中的占比一直很高。担子菌门在发酵初期的占比很低，随着降解的进行才逐渐大量繁殖，这主要是由于担子菌门是纤维素和木质素的主要分解菌，随着发酵末期纤维素和木质素相对含量的再次增加，担子菌门的占比也随之提高。由图4（b）可以看出，真菌群落在属水平上主要为酵母菌（Meyerozyma）属和镰刀菌属（Fusarium）。当青霉菌添加量为0.3%时，镰刀菌属的占比达到了84.26%，镰刀菌属具有较强的木质素和纤维素降解能力，在发酵末期时仍有较高的丰度。随着部分菌属丰度的逐渐提高，青霉菌的生长受到了抑制，但青霉菌的添加对秸秆好氧发酵复合菌系的微生物群落结构产生了显著影响。

图4 好氧发酵末期，真菌在门和属水平的相对丰度Fig.4 The species composition of fungal at the Phylum and Genus level at the end of aerobic fermentation

细菌是降解纤维素和半纤维素的重要微生物种群。好氧发酵末期，细菌在门和属水平的相对丰度如图5所示。

图5 好氧发酵末期，细菌在门和属水平的相对丰度Fig.5 The species composition of bacteria at the Phylum and Genus level at the end of aerobic fermentation

从图5（a）可以看出，在好氧发酵末期，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主导菌门，在添加青霉菌的处理组中，变形菌门的占比均远高于对照组，而厚壁菌门（Firmicutes）则相反，其在对照组的占比高达93.57%，这说明青霉菌可提高变形菌门的占比，抑制厚壁菌门的生长。从图5（b）可以看出，乳杆菌属（Lactobacillus）在对照组的占比很高，为76.70%，添加青霉菌后，其占比几乎为零；寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）在发酵末期的占比较大，且其在V3，V4，V5组的占比差别不大。

在细菌和真菌的协同作用下，秸秆中的木质纤维素大量降解。当青霉菌添加量为0.3%时，可大幅提高镰刀菌属和纤维菌属两大菌落的占比，这对于木质纤维素的降解有很大的促进作用，主导菌落占比的大幅增加可能也进一步提高了秸秆的腐熟程度。

3 结论

①添加青霉菌可以提高秸秆复合菌系在好氧发酵过程中对木质纤维素的降解，其中降解率提高最明显的是半纤维素，其次是木质素和纤维素。但整体而言，添加量超过0.3%时，其效果与添加量为0.3%的差别不大。

②添加青霉菌可有效提高漆酶的活性，但对木质素过氧化物酶的活性有不利影响；漆酶活性随着青霉菌添加量的增加而升高，木质素过氧化物酶活性则随着青霉菌添加量的增加而降低；添加青霉菌对木聚糖酶活性的影响不大。秸秆中总腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比均随着青霉菌添加量的增加而增加，并在青霉菌添加量为0.3%时达到最高，继续提高青霉菌添加量，胡富比会有所降低。

③添加青霉菌可提高担子菌门、变形菌门和放线菌门的占比，抑制厚壁菌门的生长。但青霉菌与其他木质纤维素降解菌存在竞争关系。随着秸秆好氧发酵的进行，青霉菌的生长逐渐处于不利地位，但青霉菌的存在改变了微生物的群落结构，促进了秸秆的降解与腐熟。