响应面法优化大花海棠不定芽诱导技术研究

翟懿铭， 严 瑞， 李林山， 张 黎

(1.银川能源学院， 宁夏 银川 750100； 2.宁夏大学， 银川 750021)

大花海棠(Begoniabenariensis)为秋海棠科秋海棠属多年生草本花卉[1]，作为园林景点的重要用花，在高温环境中生长良好。“比哥”系列是大花海棠杂交一代品种，花期长，花朵硕大，色彩艳丽，在全光照和半阴环境下均开花良好。目前国内对大花海棠“比哥”的研究主要集中在穴盘播种繁殖和扦插生产技术两个方面[2-3]。由于大花海棠播种繁殖时种子萌发率低，生长周期长；扦插易导致观赏性状退化，影响生产效益，而组培快繁技术在花卉生产中已被广泛应用且效果显著，可以有效解决大花海棠种苗再生以及快速繁殖等问题。

本试验采用离体培养方法，获得遗传性状一致的植株[4]。目前对大花海棠不定芽的诱导研究未见报道，本研究利用响应面回归分析法[5]，在大花海棠离体培养的基础上，通过响应面法对不同植物生长调节剂进行筛选与优化，开展脱毒苗的不定芽诱导以及快速增殖研究，对大花海棠的后续规模化发展有一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 材 料

大花海棠(Begoniabenariensis)“比哥”取自宁夏银川市花木公司。选取当年新抽、无病虫害、生长健壮的大花海棠顶部带芽幼嫩茎段作为外植体。

1.2 方 法

1.2.1外植体灭菌

将大花海棠幼嫩茎段用自来水洗净，切成2～3 cm的小段， 然后用流水冲洗30～60 min，并用毛笔刷洗表面。用无菌水冲洗4次后置于超净工作台，经过酒精震荡与无菌水冲洗后，放入0.1%的升汞中震荡3～5 min(视材料木质化程度)取出用无菌水冲洗4次。最后将茎段取出用手术刀将材料接触升汞的部分切除，接入MS培养基。

1.2.2培养条件

以MS为基本培养基， 调整pH值为6.4～6.8。培养条件为：温度(23±1)℃， 在12.75～19.25 μmol/(m2·s)光强下不定芽诱导和芽增殖的光照时间均为12 h/d。

1.2.3茎段不定芽诱导单因素试验

以6-BA、NAA、TDZ和2，4-D为响应指标，采用单因素轮换法依次考察6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L)、TDZ(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)、2，4-D(0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L)、NAA(0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L)。每个处理接种10瓶，每瓶2个外植体，重复3次。培养45 d后观察记录发芽个数并计算出芽率。

使用LSD检验法，对单因素分析来判断各组间水平的差异性。

1.2.4茎段不定芽诱导优化响应面试验

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验设计与分析进行3因素3水平响应面优化(表1)。研究大花海棠“比哥”茎段诱导出不定芽的关键因素， 以获得芽分化最佳的条件参数。

表1 大花海棠“比哥”初代不定芽诱导优化BBD试验因素与水平

根据单因素试验结果及文献[6]、文献[7]，在单因素试验的基础上筛选出对茎段愈伤诱导不定芽影响最显著的3个因素(6-BA、TDZ和2，4-D)，并筛选出有效浓度范围，以出芽率(Y)为响应值，以对大花海棠诱导不定芽影响显著的3个因素：6-BA浓度(X1)、TDZ浓度(X2)和2，4-D浓度(X3)为考察因素。共17组试验，重复3次，培养条件见1.2.2。

1.2.5继代丛芽增殖

根据CCD设计原理，因素的取值范围见表2。

表2 因素水平表(水平赋值表)

1.2.6数据统计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1不同浓度6-BA对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的影响

由图1可知，当6-BA浓度为0.5 mg/L时，大花海棠在培养第23天可以诱导出不定芽，出芽率为14.4%。当6-BA浓度增加到1.0 mg/L时，不定芽的出芽率最高(24.47%)，此时膨大率达到最高值(21.54%)，同等条件下出芽天数所需时间较短(17 d)。原因可能是6-BA浓度越高，出芽率随之增加，但过高反而抑制了外植体不定芽的萌发；而且6-BA的添加量决定了不定芽萌发的时间，6-BA浓度过低或过高同样影响出芽率。综上所述，6-BA对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的最佳浓度为1.0 mg/L 。

图1 不同浓度6-BA对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的影响

2.1.2不同浓度TDZ对大花海棠愈伤组织诱导不定芽的影响

由图2可知,不同浓度的 TDZ对大花海棠不定芽出芽率的影响有极显著差异。当浓度在0.5～1.0 mg/L范围内,出芽率与膨大率最高分别达到22.7%、21.3%,出芽天数下降至13 d。当浓度为1.5 mg/L时组培苗出芽率降至17.3%,愈伤膨大率仅19.7%。说明同等条件下TDZ浓度高于1.0 mg/L会抑制不定芽的诱导。综上所述,TDZ的最佳浓度为1.0 mg/L。

图2 不同浓度TDZ对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的影响

2.1.3不同浓度的2，4-D对大花海棠增殖倍数的影响

由图3可知，2，4-D对大花海棠的出芽率和出芽天数有显著影响。当浓度为0.3 mg/L时，大花海棠的出芽率最高(26%)，且出芽所需时间较短(25 d)。原因可能是浓度过高或过低都抑制不定芽诱导，从而影响膨大率和出芽时间。当浓度为0.5 mg/L时，膨大率由26.8%降至23.1%。综上所述，2，4-D对大花海棠增殖影响的最佳浓度为0.3 mg/L。

图3 不同浓度2，4-D对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的影响

2.1.4细胞分裂素NAA对大花海棠增殖倍数的影响

由图4可知,随着NAA浓度的变化，不定芽出芽率存在极显著差异。在0.1～0.3 mg/L浓度范围内，出芽率和膨大率最高分别达到12.4%、28.2%，出芽天数最低为24 d。当NAA浓度为0.5 mg/L时,组培苗出芽率最高仅15.5% ,愈伤膨大率仅15.2%。说明NAA浓度过高会降低组培苗发芽率并抑制愈伤膨大，出芽天数增加。综上所述,NAA的最佳浓度为0.3 mg/L。

图4 不同浓度NAA对大花海棠“比哥”愈伤组织诱导不定芽的影响

2.2 植物生长调节剂组合对大花海棠茎段不定芽诱导的影响

2.2.1Box-Behnken模型的建立

培养1～2周后， 随着腋芽逐渐膨大，茎段基部出现愈伤化黄绿色块状物(图5)。表3所示的17组试验中，所有组合均可诱导出芽，其中第6组合诱导率最高，达81.3%，第17组合诱导率最低，仅为56.8%，两者相差24.5%。

图5 大花海棠“比哥”培养14 d后不定芽诱导情况

表3 大花海棠“比哥”不定芽诱导条件优化BBD试验结果

2.2.2模型拟合与优化

运用Design-expert V 11.0.4.0软件对表5结果进行拟合，得回归方程：Y=78.52+1.24X1+1.01X2+2.28X3-6.18X1X2-3.15X1X3-2.75X2X3-8.75X12-6.65X22-4.62X32。对上述回归方程进行方差分析，结果表见表4。

表5 不同处理组合丛芽增殖倍数试验结果

由方差分析可知(表4)，3个因素对增殖倍数影响的主次顺序为6-BA>TDZ>2，4-D。其中，所有一次项结果影响均为极显著；交互项中X1X2影响极显著，X1X3、X2X3影响对结果影响为显著；X12、X22影响极显著，X32影响显著。且显著性检验差异显著(F=9.89，p<0.05) ；经失拟性检验不显著(F=3.18，p>0.1)，拟合情况较好(图6 A)。

表4 方差分析

故利用解该回归方程确定3种植物生长调节剂最佳互作配比，以芽诱导率为指标解回归方程得最佳浓度：X1=1.92 mg/L，X2=0.76 mg/L，X3=0.25 mg/L。

2.2.3响应分析

由图7可知，6-BA浓度不变，随着TDZ和2，4-D的增大，诱导率整体趋势呈先增加后降低；等高线呈闭合的椭圆形且响应面凸起，表明TDZ和2，4-D交互作用较强且有最大值。当固定2，4-D时，随着TDZ和6-BA的增大，诱导率呈先增后降的趋势；响应面凸形，表明TDZ和6-BA交互作用最大。当固定TDZ时，随着2，4-D和6-BA浓度的增加，诱导率同样呈抛物线趋势；等高线为闭合椭圆形且响应面为凸形，说明2，4-D用量和6-BA交互作用较强且有最大值。上述分析和表4中显著性分析结果一致，且正态分布合理(图6 A)，经验证性试验验证配比MS+1.03 mg/L TDZ+1.95 mg/L 6-BA+0.26 mg/L 2，4-D， 平均诱导率为82.69%，证明该模型具有可行性(图6 B)。

图6 A为残差概率正态图；B为实际与预测的出芽率线性相关图

图7 茎段诱导不定芽出芽率随6-BA、TDZ和2，4-D变化的响应面图及对应的等高线图

2.3 丛芽增殖倍数及生长情况

2.3.1建立模型

利用软件对表5进行二次多项回归拟合，计算出诱导丛芽培养基中6-BA(X1)、NAA(X2)对增殖倍数(Y)的二元回归方程。回归方程为Y=5.22+0.215X1-0.085X2-0.22X1X2-0.286 4X12-0.428 9X22。其中，相关系数R2=0.95，校正系数R2=0.92。

2.3.2丛芽增殖模型拟合与优化

由方差分析可知(表6)，调整系数为0.979，信噪比大于4，说明模型可靠。2个因素对增殖倍数影响的主次顺序为6-BA浓度>NAA浓度。一次项中X1对结果影响极显著，X2影响显著；交互项对结果影响显著，二次项影响极显著。

表6 回归模型各项方差分析

残差正态图显示，残差紧紧围绕对角线分布，满足正态性，模型合理可用(图9 A)， 本实验研究了模型推测出的最佳植物生长调节剂配比MS+1.01 mg/L 6-BA+0.32 mg/L NAA对大花海棠增殖倍数的影响，该组合的大花海棠茎段理论增殖倍数为5.24。经验证性试验表明， 该组合的平均增殖倍数为5.31，误差仅为0.18%，证明方程拟合效果好(图9 B)，且该模型具有可行性。

图8 丛芽增殖

2.3.3响应分析

根据回归方程做出相应响应面和等高线，考察6-BA和NAA对大花海棠茎段增殖倍数的影响。由图10所示，等高线呈闭合椭圆状且3 D图中6-BA坡度大于NAA，说明6-BA和NAA相互作用显著，而6-BA在培养基中的浓度变化对增殖倍数影响高于NAA。

A为6-BA与NAA增殖倍数响应面图；B为6-BA与NAA增殖倍数等高图

3 结论与讨论

本试验利用响应面试验设计方法筛选出大花海棠脱毒苗最佳启动条件和增殖条件，李莉等[8]研究证明，此方法是选择最佳试验方案的一种高效、直观、快速的试验设计方法，目前已有将此方法用于植物组培的报道[9]，如彭文丽等[10]、段新钰等[11]、谢勇武等[12]对油梨、猕猴桃和金线莲的研究。本试验采用响应面法验证了大花海棠快繁不同生长阶段的植物生长调节剂的互作效应，证明了该方法在筛选最佳配方上的高效性和科学性。邓仁菊等[13]研究发现，外源激素在茎段直接诱导不定芽过程中起着重要的作用。因此本试验在外植体选择上，利用大花海棠成熟植株带顶芽(或腋芽)的茎段，并通过添加植物生长调节剂达到茎段直接诱导不定芽的目的。

综上所述，本研究采用响应面法优化试验设计，探索出了大花海棠脱毒苗不同阶段的植物生长调节剂最佳配比，培养出了遗传性状与母本一致的大花海棠脱毒苗，具有潜在园林应用价值。

图9 A为残差概率正态图，B为实际与预测的增殖倍数之间的线性相关图