PFN2在胃癌组织中高表达并促进胃癌细胞的增殖和迁移

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率及发病率均位居恶性肿瘤前列。Profilin（PFN）是一种肌动蛋白结合蛋白，可以高亲和力结合ATP-肌动蛋白单体并催化肌动蛋白丝上的核苷酸交换（ATP取代ADP）。这种由ATP水解驱动的定向肌动蛋白丝生长，是细胞运动、形态变化和许多细胞转运事件的驱动力。而PFN2是PFN家族的一种同工型蛋白，是肌动蛋白聚合的特征明确的调节剂。既往研究认为PFN2主要在脊椎动物的神经元中表达，且相关研究都涉及其对谷氨酸能神经元神经递质胞吐相关作用。最近研究发现，在不同类型的癌症中PFN2的表达会发生改变。例如，在乳腺癌组织中PFN2表达显著上调；在口腔鳞状细胞癌中，PFN2可以抑制肿瘤的生长和侵袭；PFN2与食管鳞状细胞癌的预后不良相关，被认为是治疗靶点；PFN2可以促进HT29人结肠直肠癌干细胞的迁移和侵袭。PFN2已被证实在多种肿瘤的发展中发挥重要效能，而它的表达和功能在胃癌中是未知的。此外我们通过检索TCGA 数据发现，胃癌组织中高表达的PFN2的患者较低表达者预后更差。虽然胃癌的诊断及治疗方法已有进步，但对于晚期胃癌患者并无令人满意的疗效。常规的肿瘤标志物如癌胚抗原、糖类抗原ca19-9不能作为胃癌的特异性指标，且胃癌早期的临床表现及体征也不典型，这导致胃癌的早期诊断率较低。进一步探索特异性及灵敏性更高的检测指标和新的治疗靶点十分必要。结合PFN2在其它恶性肿瘤中的作用以及其生物学特征，它在胃癌的发展中可能也发挥了关键作用。本研究旨在从实验基础上为PFN2作为胃癌诊断的生物学标志物、预后评价指标、生物治疗靶点提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2006年7月～2007年4月在本院行胃癌根治术的患者共100例（其中80例癌组织具有相应的癌旁组织）。本研究中所有纳入患者均由病理证实为胃癌，并严格遵守纳入、排除标准。纳入标准：（1）患者依从性好，临床资料完整；（2）患者知情同意本研究，能完成随访。排除标准：（1）合并其他部位恶性肿瘤的患者；（2）合并其它可能影响血清中肿瘤标记物表达的疾患；（3）存在自身免疫系统疾病、精神类疾病、妊娠、哺乳等可能影响本研究结果的患者。本研究通过了医院伦理委员会审批（编号：KJ20201008）。

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选用人胃癌MKN-45细胞（皖南医学院弋矶山医院中心实验室细胞库），培养基使用含10%血清RPMI 1640，并培养于培养箱中，具体进行养育的环境设置为5%CO、恒温37 ℃。

1.2 方法

1.2.1 临床数据收集 对所有纳入研究的患者进行临床数据收集，收集患者临床资料包括性别（男性、女性）、年龄（≤60岁、＞60岁）、肿瘤大小（≤5 cm、＞5 cm）、病理分级、TNM分期、临床分期等数据。

1.2.2 组织芯片制作 手术切除标本常规石蜡包埋，首先在HE染色切片上进行定位，制成两块组织芯片模块。选取癌组织100个位点,癌旁正常组织80个位点，取样针直径2 mm，制作2个芯片蜡块，以4 μm厚度连续切片，敷贴于经1%多聚赖氨酸处理的载玻片，分别进行HE染色供形态学观察及免疫组化检测。

1.2.3 免疫组化 采用免疫组化染色方法,观察整张组织切片,每个芯片在电镜下随机选择四域,并采用免疫组化染色阳性率评分，即由染色强度和密度确定评价。染色强度计分：0分（阴性），1分（弱阳性），2分（中正），和3分（强阳性）；染色阳性率计分：0分（阴性），1分（1%～20%），2 分（21%～40%），3 分（41%～60%），4 分（61%～80%），5分（81%～100%）。以“染色强度”计分和“染色阳性率”计分的乘积为总分。

1.2.6 Western blot 将分组处理后的MKN-45细胞，使用预冷的PBS洗涤细胞2次，然后加入细胞裂解液（含PMSF，碧云天）冰上裂解细胞30 min，收集细胞裂解液，放入超高速低温离心机进行离心，预冷4 ℃，离心20 min，12 000 r/min。收集的上清液，中加入SDS上样缓冲液煮沸6 min，取等量蛋白进行SDS-PAGE。电泳分离的蛋白结束后，将蛋白转印至NC膜上。然后用5%BSA（索莱宝）室温封闭2 h。TBST 清洗后加入相应一抗（Abcam 公司PFN2 抗体，1∶500 稀释）4 ℃孵育过夜。TBST清洗后加入二抗（1∶10 000稀释，CST公司）室温孵育2 h，TBST清洗后3次后用化学发光成像系统检测实验结果。使用Image J软件对蛋白表达进行半定量分析。

纳入研究的100例患者中，男性64例、女性36例，年龄为32～81岁，随访到2015年7月（8～9年）。其中部分患者临床资料缺失（2例年龄不详，2例肿瘤大小不详，1例T分期不详，2例N分期不详，1例M分期不详，2例临床分期不详，3 例患者失访）。通过胃癌组织中PFN2蛋白表达和胃癌患者临床指标（性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、临床分期）进行检验分析，结果显示PFN2蛋白在胃癌组织的表达水平和胃癌病人的M分期正相关，差异有统计学意义（＜0.05，表1）。

组织芯片中可见PFN2蛋白表达的结构保存完好，位点共180个，排列整齐，免疫组织化学的染色结果良好，阳性染色呈棕黄色颗粒（图1）。部分位点无法判读，包括6例癌组织和5例癌旁组织，在可以判读的位点中，94例胃癌组织中，PFN2蛋白表达水平最低评分1.00，最高评分15.00，平均分为5.88±2.74；而75例癌旁组织中，PFN2蛋白表达水平最低评分1.00，最高评分8.75，平均分为0.88±1.83。通过数据分析显示，PFN2蛋白在胃癌组织的表达水平显著高于癌旁组织，有差异有统计学意义（＜0.01）。

通过Transwell 细胞迁移实验检验control-vector组与PFN2-vector 组迁移能力。结果显示：对照组MKN-45细胞较实验组迁移能力更强，差异有统计学意义（＜0.001，图8）。

1.2.4 样本分组及处理方法 使用耶鲁大学开发的软件X-tile，根据胃癌患者的总生存期，确定分组临界值，PFN2表达评分≤5分为低表达组，＞5分为高表达组。将研究对象分为癌组织中PNF2高表达组（46例）、低表达组（48例），以及癌旁组织中PFN2高表达组（26例）、低表达组（49例）。统计分析每组胃癌组织中PFN2表达情况与临床特征的关系、胃癌组织中PFN2与ki67、p53、VEGFR、CD133的表达相关性、PFN2蛋白表达与胃癌患者生存期的相关性。

1.2.7 CCK-8实验 将分组处理后的MKN-45细胞种植于24孔细胞培养板，至细胞贴壁。采用CCK-8试剂盒（碧云天）检测，具体操作按厂家提供的说明书进行。使用酶标仪450 nm波长测量并记录分析。

1.2.8 Transwell实验 分组处理后的MKN-45细胞，用无血清的RPMI 1640培养基重悬，吸取100 uL细胞悬液置于小室上层，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基600 μL置于下层。培养箱中培养24 h。PBS溶液清洗后，用棉棒擦除底膜上层的细胞，底膜下层的细胞用多聚甲醛固定30 min。PBS溶液再次清洗，使用结晶紫染色10 min。PBS溶液清洗后，放置在显微镜下观察并拍照。

1.2.9 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。对PFN2在癌组织及癌旁组织表达差异采用检验；PFN2表达与临床数据特征的相关性采用χ检验；对胃癌组织中PFN2、ki67、p53、VEGFR、CD133的表达相关性分析采用Spearman秩相关系数；采用Kaplan-Meier 生存分析法和log-rank 统计检验进行生存期单因素分析；多因素分析采用Cox风险回归模型。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中PFN2的表达

1.2.5 细胞实验分组及处理方法 体外培养人胃癌MKN-45细胞，使用lip2000（ThermoFisher）进行转染，将PFN2 siRNA与NC siRNA别分转染至MKN-45细胞PFN2 siRNA 组和control-siRNA 组，使用Western blot验证siRNA转染后对细胞中PFN2表达的干扰效果，再通过Transwell实验、CCK-8实验来对比成功转染siRNA的两组MKN-45细胞的迁移能力及增值能力；将PFN2 vector 与NC vector 别分转染至MKN-45 细胞PFN2 vector组和control vector组，使用Western blot验证vector转染后PFN2过表达效果，再选取Transwell实验、CCK-8实验对比成功转染vector的两组MKN-45细胞的迁移能力及增值能力。

2.2 胃癌组织中PFN2表达情况与临床特征的关系

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2.3 胃癌组织中PFN2、ki67、p53、VEGFR、CD133的表达相关性分析

通过对免疫组化染色胃癌组织中PFN2、ki67、p53、VEGFR、CD133 的表达情况进行Spearman 相关性分析。统计分析结果显示：在胃癌组织中，PFN2表达和VEGFR表达呈现正相关关系，差异有统计学意义（＜0.01，表2）。

2.4 PFN2蛋白表达与胃癌患者生存期的相关性分析

通过Western blot 检测control-vector 组与PFN2-vector组PFN2蛋白表达水平。结果显示转染后成功敲低MKN-45细胞PFN2蛋白表达水平，差异有统计学意义（＜0.001，图6）。

2.5 敲低PFN2蛋白表达对人胃癌细胞MKN-45增殖、迁移功能影响

通过Western blot检测control-siRNA组与PFN2-siRNA组PFN2蛋白表达水平。结果显示转染后成功敲低MKN-45细胞PFN2蛋白表达水平（＜0.001，图3）。

国有粮食企业产权制度具体怎么改，不同学者从不同角度提出了自己的见解。王锐青[43]提出要扶持壮大规模大、有竞争力的购销企业，稳步推进产权制度改革，积极引导管理层转变观念，发挥企业所长，积极参与市场竞争。刘颖等[44-45]认为国有粮食企业产权制度改革的关键在于建立现代企业制度，而建立现代企业制度要实现从政企分开到改善政府宏观调控、由计划主导向市场主导、由减员增效向推进产权制度改革三个转变。同时刘俊[46]指出随着粮食企业产权制度改革的深入，会出现数量不等的闲置资产，所以完善产权制度改革需要盘活这些限制资产。

通过CCK-8 细胞增殖实验检验两组细胞增殖能力。结果显示：control-siRNA组较PFN2-siRNA组增殖能力更强，差异有统计学意义（＜0.001，图4）。

通过Transwell细胞迁移实验检验control-siRNA组与PFN2-siRNA组迁移能力。细胞计数后，通过检验统计分析，结果显示：PFN2-siRNA组MKN-45细胞较Control-siRNA组迁移能力更弱，差异有统计学意义（＜0.001，图5）。

2.6 过表达PFN2蛋白表达对人胃癌细胞MKN-45增殖、迁移影响

对纳入的100例胃癌病人进行随访8-9年结果分析，其中26例生存，71例死亡，3例失访。对结果进行Kapla-Meier 生存曲线分析，结果显示：胃癌组织中PFN2蛋白高表达的患者较低表达患者预后显著更差，差异有统计学意义（＜0.01，图2）；而癌旁组织中PFN2蛋白高表达的患人同样较低表达的患者预后更差，差异有统计学意义（＜0.01，图3）。将单因素分析中有统计学意义的变量纳入COX多因素生存回归分析，结果显示：PFN2蛋白癌组织表达分组是胃癌病人的独立预测因子（＜0.05，表3）。

1.2.4 流式细胞术分析细胞周期 实验分组与细胞转染步骤相同，转染48 h后按说明书收集和处理细胞，上机检测各组细胞周期，结果用modfit软件进行分析，实验重复3次，每次设3组平行重复。

通过CCK-8 细胞增殖实验检验control-vector组与PFN2-vector组增殖能力。结果显示：PFN2-vector组MKN-45细胞较control-vector组增殖能力更强，差异有统计学意义（＜0.001，图7）。

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3 讨论

PFN2属于PFN家族4个成员组成之一，一同参与肌动蛋白的单体结合并介导肌动蛋白的聚合。研究发现PFN2在中枢神经系统中表达，并参与调节突触的结构和功能。虽然PFN2表达于中枢神经系统，但也广泛表达于其他组织细胞中。在源自各种组织（包括肺，结肠和食道）的癌症中，PFN2的表达对癌细胞迁移和增殖具有重要作用。在癌症治疗研究上，基因治疗一直是研究的前沿和重点。而PFN2能否促进胃癌细胞增殖和迁移尚未见报道，因此研究PFN2对胃癌的影响具有重要意义。

本研究通过免疫组化发现胃癌组织中PFN2高表达，意味着PFN2有促进胃癌发生发展的可能。因为PFN2分布广泛且作用于肌动蛋白，与细胞的运动、细胞突起等发生的形态上改变、细胞质分裂、物质的运输功能密切相关。结合PFN2基因是一个生物进化中非常保守的基因，说明PFN2可能发挥促进癌症的发生发展的重要作用，也可能成为早期胃癌诊断的新指标。

VEGFR是血管内皮生长因子（VEGF）的受体，是人体重要的信号蛋白。VEGF/VEGFR信号传导主要负责肿瘤血管生成，是抑制肿瘤生长和抗血管生成治疗的主要靶途径。本研究通过PFN2与血管内皮生长因子受体（VEGFR）抗体相关性分析发现，在胃癌组织及癌旁组织中PFN2表达和VEGFR表达显著正相关，表明PFN2和VEGFR可能存在相互作用。现已有许多有效对抗VEGF表达的抗癌药物，如阿柏西普治疗转移性结肠癌、贝伐单抗治疗肺癌和结肠癌等多种癌症，还有雷莫芦单抗，用于胃癌患者治疗。这表明PFN2作为下一个胃癌靶向治疗的新兴方向的有着巨大潜力。

合理的绩效目标是进行科学绩效评价的前提，探索和建立农业科研项目绩效目标，将使得评价过程更为合理，从而实现农业科研项目的经济效益、社会效益。相关科研人员应当立足科研项目本身，结合农业科研项目的具体特点，根据项目研究所要达到的目的设定绩效目标。科研管理人员应当注重绩效目标的具体化，对目标进行细化、分解，对不符合要求的目标予以调整，实现目标管理全过程、全覆盖。明确的绩效目标可以帮助科研人员对项目进展及时进行监控，不断纠正项目执行过程中的偏差，更大程度上发挥目标管理的功能，使得绩效评价成为一项有效的管理手段。

在PFN2蛋白表达与患者预后上，本研究也显示在胃癌组织中PFN2蛋白高表达的病人的预后显著更差，而癌旁组织中PFN2蛋白高表达的病人预后同样更差，此外COX多因素生存回归分析结果也显示，PFN2表达是胃癌的独立危险因子。这些数据说明，PFN2可以作为胃癌预后的预测指标。

在胃癌细胞功能上，我们通过对胃癌MKN-45细胞系研究发现，过表达PFN2蛋白可以明显促进细胞的增殖和迁移，而敲低PFN2蛋白则出现细胞的增殖和迁移能力减弱。PFN2蛋白在胃癌细胞功能结果上显示，在细胞功能层面上，PFN2蛋白有着促进胃癌细胞的增殖和迁移能力。

本研究也存在不足之处：（1）纳入的病例数量较少，仍需更多的病例；（2）在胃癌中的具体作用机制仍在进一步研究中。

综上所述，本研究结果显示PFN2蛋白在胃癌组织表达显著高于癌旁，发现了PFN2表达和VEGFR表达显著正相关，还评估了PFN2蛋白的表达和胃癌病人的临床分期以及预后的关系，最后在细胞层面上发现PFN2蛋白起促进胃癌细胞增殖和迁移的作用。我们认为PFN2蛋白有成为胃癌早期诊断生物学标志物、预后评价指标及治疗靶点的巨大潜力。