氮磷养分对荧蒽污染土壤修复的应用研究

陈雪梅，张馥颖，朱雪竹，赵海燕，吕百韬

（南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095）

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）主要来源于化石燃料的燃烧。随着经济的发展，环境中PAHs污染被多次报道。PAHs可以在环境中长期存在，并可通过食物链进入人体，从而增加人类患癌风险。由MA 等对某城市的土壤污染调查报道可知，该城市土壤中以荧蒽（14.4%）和芘（12.4%）等4 环和3 环PAHs 为主。YANG 等研究的某特大城市路边农业表层土壤中16 种PAHs 的污染浓度为17.2~3 775.0 ng·g，工业区和居民区附近的农业土壤PAHs 污染最严重，荧蒽浓度为614 ng·g。张俊叶等的土壤调查表明，中国主要地区表层土壤中16 种PAHs 总量（中位值）为515.70 ng·g，和其他国家相比处于中等水平，其中荧蒽占总含量的10.39%。平新亮等对某工业区的土壤调查显示，土壤中荧蒽的含量范围为0~212.0 ng·g，均值为53.5 ng·g。

PAHs污染土壤的治理是目前亟需解决的环境问题之一。荧蒽作为一种4 环的PAHs，普遍存在于我国土壤中，尤其是经济发达的长三角地区、珠三角地区和环渤海地区，是美国环境保护署优先控制有机污染物黑名单中典型的代表性PAHs。有调查显示，荧蒽在燃烧产生的PAHs 中含量最高，其性质稳定、易在环境中沉积，因此常被作为环境中PAHs 污染物的指示化合物。

PAHs在环境中降解的限制因素有生物和非生物两类，PAHs降解微生物为主要生物因素，利用微生物修复污染土壤具有成本低、效果好以及对环境二次污染小等优点。非生物因素通常为氮、磷、氧气等营养因子和电子受体等，通过添加上述营养元素改善生物降解能力的方法称为生物刺激法，该方法在实际的生物修复过程中具有易操作、效果显著等特点。自然条件下，植被生长与施肥是影响微生物修复效果的两个重要因素，土壤中的氮磷养分对微生物活力存在促进作用。

PAHs污染土壤修复中的关键问题是如何通过添加合适的氮磷养分从而达到高效去除土壤中PAHs污染的目的。土壤微生物量是土壤质量和酶活性的重要反映。脲酶活性与土壤有机氮的转化能力、土壤无机氮的供应能力密切相关。土壤磷酸酶酶促反应能够加速土壤有机磷的脱磷速度，在土壤的磷素循环中起重要作用，其活性的高低可直接影响土壤磷素有效化强度的强弱。多酚氧化酶是芳香族化合物氧化成醌的关键酶。

考虑到江苏地区土壤以黄棕壤为主，因此本研究选择黄棕壤为江苏地区土壤代表，荧蒽为PAHs 代表污染物，分析外加氮磷对土壤中荧蒽的消除速率，以及对与PAHs 降解密切相关的土壤酶活性的影响，阐明氮磷养分促进黄棕壤中荧蒽消减的机理，以期为黄棕壤中PAHs污染土壤修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄棕壤采自南京市某农田表层（0~20 cm），土壤理化性质见表1。土样风干后研磨过10目筛，向土样中加入10 mg·mL的荧蒽丙酮溶液，制备荧蒽终浓度为100、200 mg·kg的污染土壤，老化备用。标准样品荧蒽购自Sigma−Aldrich 公司，标准储备液采用丙酮配制。

表1 供试土壤理化性质Table 1 Physicochemical properties of the tested soil

供试化肥：氮肥，通用名称为尿素CO（NH），总氮≥46.4%，安徽金秋肥业有限公司。磷肥，通用名称为过磷酸钙CaPHO，有效磷≤12%，连云港新磷矿化有限公司。

1.2 试验设计

本研究选择荧蒽作为目标污染物，浓度设置为100 mg·kg和200 mg·kg，分别添加不同量的氮肥（以TN表示，总氮≥46.4%）和磷肥（以TP表示，有效磷≤12%）。具体试验设计见表2。

表2 试验设计（mg·kg−1）Table 2 Experimental design（mg·kg−1）

称取200 g 污染土壤于250 mL 烧杯中，分别添加肥料混合均匀，调节水分至田间持水量（24.7%）的80%，即土壤最终含水率为19.76%。用保鲜膜封口，膜上用针扎小孔若干以保证通气，然后置于（25±1）℃恒温培养箱中黑暗培养，培养期间每日以称质量的方法补充水分以维持试验设定的含水量。分别在第7、15、30、60 d 整瓶取出培养样品，采集土壤样品，测定其中的荧蒽残留量和土壤酶活性。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤中荧蒽残留量的测定

测定方法参考文献[16−17]。污染土壤样品置于玻璃离心管中，加入二氯甲烷，超声（80 Hz）1 h。以2 500 r·min离心10 min。取上清液过无水硫酸钠−硅胶柱，再用正己烷和二氯甲烷混合溶液（体积比1∶1）洗脱。将洗脱液收集到50 mL旋转蒸发瓶内，于40 ℃下恒温旋转蒸发浓缩至干。用乙腈定容至2 mL，过0.22 μm 滤膜后待液相测定。每个土样设置3 个平行，两种荧蒽污染浓度土壤各测定一组不加被测物质，而加入定量标准物质的空白对照的回收率，当土壤中荧蒽污染浓度分别为100、200 mg·kg时，回收率分别为85.5%~94.8%和86.0%~95.5%。

利用高效液相色谱法（Agilent1260型自动进样高效液相色谱仪，美国安捷伦公司）测定土壤中荧蒽残留量。色谱柱：ZORBAX Eclipse PAH 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。检测条件：柱温35 ℃，流速1.0 mL·min，进样量20 μL，紫外检测器检测波长230 nm。

1.3.2 土壤荧蒽消除速率常数及生物半衰期

将各土壤中测出的荧蒽浓度与时间进行拟合，即可得公式（1）：

式中：为初始浓度，mg·kg；为测定值，mg·kg；为消除速率常数，d；为培养时间，d。

生物半衰期根据公式（2）计算：

式中：为生物半衰期，d；为消除速率常数，d。

1.3.3 土壤中酶活性的测定

分别在土壤培养试验的第7、15、30、60 d 采集新鲜的土壤样品，测定分析相关酶活性。脲酶活性采用靛酚蓝比色法进行测定，磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法进行测定，多酚氧化酶活性采用邻苯三酚法进行测定。测定的每种酶均设置3 组平行，每份土壤样品加做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，同时整个试验设置无土对照，其他操作与样品试验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解量。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 软件进行数据统计，Origin 2019进行图表绘制，SPSS 19.0 软件进行双变量（Pearson）方差显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 不同氮肥水平对土壤荧蒽残留量的影响

氮肥的添加能够显著提高土壤中荧蒽的去除率（图1），当污染土壤中氮的添加量为300 mg·kg（TN12、TN22）时，第7、15、30、60 d时污染土壤中荧蒽去除率均达到同期各处理组最高。各处理组土壤中荧蒽的去除率随着培养时间的增加而增加。与无外加氮源的CK1 相比，TN11、TN12、TN13 和TN14 中荧蒽的去除率分别提高了1.88、2.26、1.69 倍和1.57 倍（图1a）；与无外加氮源的CK2 相比，TN21、TN22、TN23 和TN24 土壤中荧蒽的去除率分别提高了4.11、4.27、1.38 倍和0.92 倍（图1b）。以上结果表明，对于本研究中的两个荧蒽污染程度，300 mg·kg氮添加量均使污染土壤的荧蒽去除率达到最高。ZHANG 等的研究也表明，适量施用无机肥（氮、磷）对土壤微生物的活性有着积极的影响，有利于土壤中污染物含量的降低。在相同外加氮源处理下，100 mg·kg荧蒽污染土壤中的荧蒽去除率比同期的200 mg·kg荧蒽污染土壤高了0.56~3.10 倍。江晴等对某市区表层土壤中PAHs和微生物量的调查结果表明，土壤中16种PAHs的含量为16~417 μg·kg，土壤中微生物量随着PAHs 含量的增加基本呈指数形式减少。由此，本研究推测荧蒽污染的增加抑制了土壤中微生物的活力，从而导致外加氮源的促进效率降低。

图1 外加氮对土壤荧蒽去除的影响Figure 1 Effects of additional nitrogen on the removal of fluoranthene in the contaminated soil

氮是植物根系和微生物代谢过程中必不可少的元素，陆地土壤中的活性氮量增加可以提高生物和非生物过程的PAHs 降解速率。杨晓东等报道了氮添加能提升土壤中营养物质的可利用性、植物根系和土壤微生物的活性，有利于降解土壤中的PAHs。王月等报道了单施氮肥、氮磷肥、氮磷钾肥等均可显著提高土壤微生物量碳、氮的含量。本研究的污染土壤中荧蒽的去除速率随着外加氮量的增加而逐渐稳定，推测是由于外加氮源为微生物提供更多的氮源，降低了黄棕壤中C/N。随着外加氮源的增加，氮已不是土壤中有机碳降解的限制因素，因此黄棕壤中荧蒽的去除率上升趋势变缓。

2.2 不同磷肥水平对土壤荧蒽残留量的影响

外加磷有效提高了污染黄棕壤中荧蒽的消除速率，100 mg·kg荧蒽污染状态下外加磷对荧蒽消除的促进作用优于200 mg·kg荧蒽污染状态（图2）。与无外加磷源的CK1 相比，处理组TP11、TP12、TP13 和TP14 土壤中荧蒽的去除率分别提高了2.37、2.33、1.95 倍和1.70 倍（图2a）；与无外加磷源的CK2 相比，处理组TP21、TP22、TP23 和TP24 土壤中荧蒽的去除率分别提高了6.48、6.40、5.68 倍和5.32 倍（图2b）。两种荧蒽污染程度的土壤中，150、300 mg·kg磷添加组中荧蒽的去除率达到相同荧蒽污染组中较高值。

图2 外加磷对土壤荧蒽去除的影响Figure 2 Effects of additional phosphorus on the removal of fluoranthene in the contaminated soil

在相同磷肥处理下，100 mg·kg荧蒽污染土壤中的荧蒽去除率比200 mg·kg荧蒽污染土壤高了0.25~2.41 倍。胡星明等的研究表明，添加磷肥可改善污染土壤质量，促进植物和土壤微生物的生长。廖朝选等的研究也表明，施磷肥能显著提高不同品种大豆土壤中微生物的数量，有效改善土壤生态环境，提高土壤肥力。周宏伟等的研究表明，湿地底泥中本底浓度的氮和磷已经能够满足3 环和4 环PAHs 的降解，外加氮磷对5 环的苯并[a]芘的降解具有显著的促进作用。

2.3 不同氮磷水平对土壤荧蒽去除速率的影响

根据消除速率常数与半衰期数据，本研究推荐在荧蒽污染土壤中最佳氮、磷添加量范围皆为150~300 mg·kg。外加氮显著降低了污染黄棕壤中荧蒽的消除速率常数值，显著缩短了荧蒽在黄棕壤中的（表3）。荧蒽消减随着氮的增加呈先上升后下降的趋势，氮添加量在150~300 mg·kg范围时，可大幅缩短荧蒽在污染土壤中的残留时间。300 mg·kg氮添加组中（TN12）对荧蒽消减促进作用最大，值最大，达到0.156 d，比CK1（0.034 d）提高了358.8%，值最小（4.4 d），比CK1（20.4 d）减少了78.4%。外加磷对土壤中荧蒽的去除速率有显著影响，其值明显高于对照，同时显著缩短。荧蒽消减随着磷的增加呈不断下降的趋势，在150 mg·kg磷添加组（TP11）中，值达到0.154 d，比CK1（0.034 d）提高了352.9%，值最小（4.5 d），比CK1（20.4 d）减少了77.9%。

表3 土壤中荧蒽残留的消除速率常数和半衰期Table 3 Elimination rate constant and half life of fluoranthene residue in soil

2.4 土壤酶活性对氮磷养分的响应

2.4.1 外源氮磷养分对脲酶活性的影响

外加氮源均显著提高了污染黄棕壤中脲酶活性（图3）。100 mg·kg荧蒽污染黄棕壤中，外加氮源对脲酶活性提高较多。马昱萱等的研究结果也表明施入氮肥能够提高脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶的活性。李瑞瑞等的研究发现氮的添加对土壤脲酶有促进作用，但作用不显著（＞0.05），脲酶活性（以NH计）在0.176 mg·g时出现最大值。氮肥对土壤中脲酶活性的促进作用明显高于对照，这是由于施用的氮肥为土壤微生物提供了丰富的氮源，从而提高了土壤全氮和速效氮含量。

图3 外加氮磷养分对土壤中脲酶活性的影响Figure 3 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the urease activity in the contaminated soil

各外加磷处理组污染土壤中脲酶活性并不一致，在100 mg·kg荧蒽污染土壤中添加磷肥，前期（7~15 d）磷对土壤中的脲酶呈现抑制作用，相比CK1降低了0.69%~20.59%，TP13处理组脲酶活性下降最多；后期（15~60 d）外加磷显著提高了土壤脲酶活性，相比CK1 提高了27.34%~50.57%。在200 mg·kg荧蒽污染土壤中，前期（7~30 d）外加磷处理组的脲酶活性显著低于CK2，降低了1.31%~23.67%；后期（60 d）外加磷处理组的脲酶活性高于CK2，提高了1.67%~7.91%。TP21 处理组脲酶活性下降最少，TP22、TP23、TP24 处理组酶活性变化没有显著差异，这与上述磷对土壤中荧蒽消除速率的影响一致。污染土壤中，外加磷对脲酶活性主要表现为先抑制再促进的作用，贺根和等的研究结果表明，磷肥能降低根际和非根际土壤的脲酶活性，这与本研究结果不尽一致。

土壤脲酶直接参与土壤中氮元素的生态循环，可将有机物中的C—N键水解生成氨、二氧化碳和水，促进有机氮向矿质氮的转化，其活性与土壤微生物数量、有机质含量和全氮含量呈正相关。陈悦的研究表明，氮的增加能够增强土壤中脲酶、脱氢酶与过氧化氢酶的活性，同时能够较好地减少土壤中萘2环与苗屈的含量，在总PAHs 的去除效果中也存在一定的正效应。

2.4.2 外源氮磷养分对磷酸酶活性的影响

各外加氮处理组污染土壤中磷酸酶活性反应并不一致，在100 mg·kg荧蒽污染土壤中添加氮肥，各处理组的磷酸酶活性高出CK1 组2.39%~23.09%（图4a）；在200 mg·kg荧蒽污染土壤中添加氮肥，外加氮对土壤磷酸酶活性既有促进作用也有抑制作用（图4b）。李瑞瑞等的研究发现，不同施氮量对酸性磷酸酶的影响显著（＜0.05），随施氮量的增加，磷酸酶活性呈增加的趋势。外加磷可显著提高荧蒽污染土壤中磷酸酶活性（图4c和图4d）。污染黄棕壤中磷酸酶活性随着磷肥的增加而增加，TP14 处理组磷酸酶提高最多。土壤磷酸酶在土壤磷的循环中起重要作用，是评价土壤肥力状况的重要水解酶，其可以将土壤中的复杂有机磷水解成可被生物直接吸收的无机磷，从而缓解了土壤磷的限制。外加磷提高了荧蒽污染土壤中的磷酸酶活性，促进了土壤中微生物对磷的利用。

图4 外加氮磷养分对土壤中酸性磷酸酶活性的影响Figure 4 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the phosphatase activity in the contaminated soil

2.4.3 外源氮磷养分对多酚氧化酶活性的影响

外加氮磷均可显著提高污染黄棕壤中多酚氧化酶的活性，且随着培养时间的延长，外加氮磷对多酚氧化酶活性的作用更显著（图5）。污染黄棕壤中多酚氧化酶在不同外加氮磷处理组的变化趋势与土壤中荧蒽消除速率变化趋势一致。在氮添加组中，当外加氮含量为150、300 mg·kg时，多酚氧化酶活性相对较高；在磷添加组中，外加磷含量为300 mg·kg时，多酚氧化酶活性相对较高。李瑞瑞等报道了外加氮可提高土壤多酚氧化酶活性。冯程程等的研究报道土壤多酚氧化酶对PAHs 污染的响应大多表现为激活效应，建议将多酚氧化酶作为土壤PAHs 污染的监测指标。多酚氧化酶为土壤中主要的木质素降解酶，能催化PAHs 开环，生成较易降解的中间产物，在PAHs降解过程中起着关键作。

图5 外加氮磷养分对土壤中多酚氧化酶活性的影响Figure 5 Effects of additional nitrogen and phosphorus on the polyphenol oxidase activity in the contaminated soil

2.5 土壤酶活性与荧蒽去除的相关性

相关性分析表明，污染黄棕壤中多酚氧化酶活性与荧蒽的去除率呈极显著正相关（r=0.850，P＜0.01），与黄棕壤中荧蒽的半衰期呈显著负相关（r=−0.612，P＜0.01）。该结果与梁小翠等的研究报道一致，樟树幼苗土壤多酚氧化酶活性与PAHs 去除率呈显著正相关（r=0.360，P＜0.05）。氮磷添加通过提高土壤多酚氧化酶活性，促进了污染黄棕壤中荧蒽的去除。由刘世亮等研究土著微生物对苯并[a]芘在土壤中的降解作用可知，多酚氧化酶活性与土壤中苯并[a]芘的降解速率相关，即多酚氧化酶活性增长越快，土壤中苯并[a]芘的降解率越高。WANG 等研究了PAHs污染土壤的生物修复及其对土壤酶活性的影响，结果也表明根际土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性与PAHs 浓度显著相关，可作为土壤PAHs 的降解指标。ZHU等的研究表明，PAHs 污染对土壤酶活性的影响较大，多酚氧化酶和磷酸酶对土壤反应敏感，多酚氧化酶可以作为修复过程中土壤环境质量的指示者。研究结果同时表明多酚氧化酶、酸性磷酸酶和脲酶间存在一定的显著相关关系，如多酚氧化酶与脲酶呈显著正相关（r=0.292；P＜0.05），这也说明微生物的各种生理代谢间存在一定的关联。

3 结论

（1）通过在污染土壤中添加氮磷养分可显著提高污染土壤中的多酚氧化酶活性，从而促进荧蒽的消除。

（2）本研究中通过外加氮磷可将土壤中的荧蒽半衰期最大缩短约78.4%。

（3）污染土壤中外加氮150~300 mg·kg、磷150~300 mg·kg时可达到较好的去除荧蒽的效果。