非编码RNA 在扩张型心肌病中的研究进展

黎伟文 邓少东 陈建英∗

(1.广东医科大学附属医院 结构性心脏病专科,广东 湛江 524001;2.广东医科大学附属东莞第一医院 中医科,广东 东莞 523710;3.广东医科大学 第二临床医学院,广东 东莞 523808)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一种不可逆转的心肌疾病,其特征为左心室增大和收缩功能障碍,从而导致心脏泵血功能降低,最终进展为心力衰竭(heart failure,HF)甚至死亡。DCM具有异质性,与遗传异常、病毒感染、心肌炎症和其他病因有关[1-2],但其发病机制尚不明确。因此,探究与DCM 相关的致病基因及其作用机制对防治具有重要意义。据报道,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)参与调控心肌发育、分化、代谢、死亡及重构等病理生理过程[3]。笔者查阅了近五年的相关研究论文,对ncRNA 在DCM 中的作用及调控机制展开综述。

1 DCM 相关ncRNA 的表达谱分析

微阵列和RNA 测序(RNA sequencing,RNA-seq)作为转录组学研究的革命性工具,可以通过分析与特定疾病相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEG)来鉴定标志物,而且有助于发现参与疾病的信号通路及调控机制。目前,针对全转录组和特定ncRNA 组的检测和分析已广泛应用于DCM 的研究中,但具体作用机制有待进一步明确。

1.1 DCM 相关小RNA

miRNA 是一种小RNA 分子,被预测在转录后水平调节近30%的基因表达,并与真核生物的发育和代谢广泛相关[4-5]。miRNA 在各种心血管疾病的发生和发展中也发挥着重要作用,如心律失常、心脏肥厚、心肌纤维化、动脉粥样硬化、心肌梗死等[6]。最近,Huang 等[7]用小RNA 测序分析发现DCM 患者外周血中48 个表达失调的miRNA 可能通过调节神经元分化过程和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路参与DCM 的发病机制。Enes 等[8]则使用微阵列检测到DCM 患儿的血浆miR-618、miR-875-3p、miR-205、miR-194、miR-302a、miR-147 和miR-544 表达水平降低,而miR-518f 和miR-454 表达水平升高。此外,Toro 等[9]采用PCR 验证携带核纤层蛋白A/C(lamin A/C,LMNA)基因致病性突变的家族性扩张型心肌病(familial dilated cardiomyopathy,FDCM)患者的循环miRNA 表达谱,发现突变携带者的let-7a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p 和miR-454-3p 水平显著升高。

相较于微阵列和测序需要采集足量数量的样本并投入较高的成本,应用生物信息学分析方法从数据库中挖掘已知信息已成为一种节省实验成本并快速获取有效信息的手段。Wang 等[10]对GEO数据库中获取的基因表达谱数据进行生物信息学分析,发现与DCM 相关的miRNA 包括miR-9、miR-200 家族和miR-30 家族。Huang 等[11]通过分析数据库中miRNA-mRNA 相互作用网络来识别DCM 的核心基因和miRNA,发现miR-144-3p、miR-363-3p、miR-9-3p、miR-21-3p、miR-144-5p、miR-338-3p 和miR-770-5p 是重要的调节因子。

以上研究提示,多种miRNA 可能是DCM 的潜在标志物和治疗靶点。然而,不同的DCM 的类型以及检测和分析方法均可能得出不同的结果,因此,需要进一步在更多临床样本和疾病模型中验证这些miRNA 的作用及机制。

1.2 DCM 相关lncRNA

lncRNA 是一组长度>200 nt 且不能编码蛋白的RNA,通过与miRNA 建立联系并与蛋白质相互作用来调节与其邻近或遥远的靶基因。研究已证实,lncRNA 通过调节心脏发育、体内稳态和再生对心血管疾病的进展发挥关键作用[12-13]。2018 年,Haas等[14]通过评估全基因组中结构变异(structural variation,SV)与人类心脏中基因表达的联系,首次确认DCM 导致HF 相关的SV 包括3758 个lncRNA和1756 个蛋白编码转录本,说明基因遗传变异引起的lncRNA 表达变化控制表型变异。Huang 等[15]通过病例对照研究发现在DCM 患者中差异表达的循环lncRNA 主要与系统发育、器官形态发生和代谢调节有关。除了关于循环lncRNA 的研究,Li 等[16]取DCM 患者的心脏样本进行微阵列分析,并鉴定RP11-21.2 和XLOC_014288 等lncRNA 在人心肌细胞、心脏成纤维细胞和心脏微血管内皮细胞中发挥不同的作用,而且可能影响患者的左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)。Cai 等[17]研究DCM 患儿外周血中lncRNA 的差异表达情况及其与左心室功能的关系,发 现NONHSAT252242.1、ENST000000596816、NONHSAT 215378.1 和NONHSAT137060.2 在心脏功能不同的患者中存在显著差异,但研究者未做进一步相关性分析。

最近研究表明,lncRNA 可以与miRNA 相互作用,并通过(competing endogenous RNA,ceRNA)机制间接与mRNA 相互作用[13]。Tao 等[18]发现DCM患者的心脏样本中miR-144-3p 和miR-451a 下调而miR-21-5p 上调,进一步分析发现,靶向miR-144/451 的两个 lncRNA (NONHSAT001691 和NONHSAT006358)与DCM 高度相关,此外,靶向miR-21 的 4 个 lncRNA (NONHSAT026953、NONHSAT006250、NONHSAT133928 和NONHSAT041662) 也 与 DCM 显著相关。Chen等[19]通过研究DCM 相关的心脏lncRNA 表达谱发现8 个候选 lncRNA (FGD5-AS1、AC009113.1、WDFY3-AS2、NIFK-AS1、ZNF571-AS1、MIR100HG、AC079089.1 和EIF3J-AS1)也可能通过ceRNA 机制发挥功能。此外,Qiu 等[20]筛选并验证了DCM 患者左心室组织差异表达的关键 lncNRA 如KB1299A7.2、RP11-13E1.5、AC061961.2、LING01AS1、RP11-557H15.4、AC061961.2、LING01AS1、RP11-1313E1.5 等主要与DCM 的疾病状态和进展有关。

此外,Charles 等[4]通过从NCBI SRA 数据库中挖掘信息构建的ceRNA 网络中鉴定出3 个主要枢纽节点,包括lncRNA(XIST)、miRNA(hsa-miR-195-5p)和mRNA(neuro oncological ventral antigen 1,NOVA1)。

以上研究揭示DCM 中lncRNA 的作用极其广泛,提示其既可作为DCM 的标志物也是影响DCM病理生理的关键因素,但是迄今仅有少数研究者做了后续研究,大多数差异表达lncRNA 的功能仍然未知,因此值得进一步探究。

1.3 DCM 相关circRNA

circRNA 与包含5’和3’端的线性RNA 不同,其具有共价连接端,形成一个闭合连续环。由于环状结构,circRNA 对RNA 酶(RNase)的降解具有抵抗力,因而比其他RNA 更加稳定。circRNA 在调节转录、转录后、翻译和翻译后水平的基因表达中发挥重要作用。最近,circRNA 的ceRNA 功能已成为一个研究热点。Lin 等[21]用来自DCM 患者和健康对照组的心脏样本通过RNA-seq 分析揭示,差异表达circRNA 调控的mRNA 与细胞大分子代谢、蛋白质修饰、细胞信号转导和蛋白质结合有关。Sun等[22]使用RNA 微阵列结合PCR 验证检测出DCM患儿外周血中circ_0067735 和circ_0069972 下调而circ_0070186 上调,其功能主要与心肌肥厚、重构、纤维化和自身免疫有关。此外,Dong 等[23]从NCBI SRA 数据库中获取信息,分析出参与DCM 异常调控的circALMS1_6 与miR-133 的结合潜力最高。

以上研究表明,circRNA 也同样地在DCM 中发挥复杂作用。然而,目前关于circRNA 与DCM 之间的联系缺乏更深入的临床验证及机制研究,亟待今后研究来填补此空白。

2 ncRNA 作为DCM 标志物的潜力

转录组学数据表明差异表达的ncRNA 可能参与DCM 的发病过程,因此三种主要的ncRNA 理论上均可以作为DCM 的标志物,虽然circRNA 具有比miRNA 和lncRNA 更稳定的结构,但迄今为止仅有miRNA 和lncRNA 被报道,主要体现为对DCM 诊断和预后的预测价值(见表1)。检测样品可以来源于患者的外周血或心肌组织,相比而言,心肌组织的特异性更高,但对外周血进行检测更为方便快捷,因此,循环ncRNA 作为一种非侵入性的生物标志物具有良好的应用前景。

表1 ncRNA 在DCM 诊断和预后预测中的作用Table 1 Roles of ncRNA in the diagnosis and prognosis of DCM

2.1 ncRNA 的诊断价值

miRNA 和lncRNA 都是外泌体携带的主要成分由于,外泌体能够保护其免被血液中的RNase 降解,因此二者可均作为潜在的DCM 标志物用于更准确的早期和鉴别诊断。Wang 等[24]检测出DCM 患者血浆中显著升高的miR-3135b、miR-3908 和miR-5571-5p 有较好的诊断潜力,而且miR-5571-5p 水平升高与DCM 的严重程度有关。Wu 等[25]发现,DCM并发急性心力衰竭患者的血清外泌体miR-92b-5p表达增加,并可作为DCM 并发急性心力衰竭的潜在生物标志物。Jiao 等[26]证实,DCM 患儿的循环miR-142-5p、miR-143-3-3p、miR-27b-3p 和miR-126-3p 可能是诊断儿童DCM 和评估HF 的潜在生物标志物,重要的是,miR-126-3p 增加与LVEF 呈显著负相关。最近,Zaragoza 等[27]研究表明,与FDCM 突变致病基因Bcl2 关联永生基因3(Bcl2 associated athanogene 3,BAG3) 相关的循环miR-154-5p 和miR-182-5p 组合具有诊断价值,然而进一步研究将需要长期随访,并扩大人群进行验证。此外,Toro等[9]证实,let-7a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p、miR-454-3p 以及它们的组合可以区分健康人、DCM 表型阴性的LMNA 基因突变携带者和LMNA 相关的DCM 患者。关于lncRNA 作为DCM 诊断标志物的研究较少。Zhang 等[28]构建了基于ceRNA 网络中6个 lncRNA (AC016722.3、AL589986.2、AC006007.1、AC092687.3、GS1-124K5.4 和AC007126.1)的多元Logistic 回归模型,证实这些lncRNA 在训练集和验证集中均显示出对DCM 诊断的高灵敏度和特异性。Luo 等[29]则利用生物信息学方法获得了107 个有潜力的lncRNA,并鉴定出中上调的IDI2-AS1 和下调的XIST 对DCM 均具有良好的诊断价值。这些研究提示,无论上调还是下调的ncRNA 都可作为DCM 的新型诊断标志物,而且单用和联用均具有较好的诊断价值。

除了 DCM,缺血性心肌病 (ischemic cardiomyopathy,ICM)也是引起HF 的一个主要原因,因此需要在分子水平进行鉴别。Lin 等[21]应用微阵列分析DCM 和ICM 患者的循环lncRNA 表达谱,发现3,222 个lncRNA 具有显著差异。但是该研究未扩大样本量验证相关lncRNA 的鉴别诊断能力。此外,Brundin 等[30]研究发现,循环miR-320a增加DCM 患者与健康对照之间的鉴别,而循环miR-29-5p 则增加DCM 与缺血性心脏病之间的鉴别。由于目前的研究有限,将来有必要筛选更多有效标志物用以鉴别诊断DCM 和其它类型心肌病。

2.2 ncRNA 的预后价值

B 细胞通过诱导心肌细胞损伤和心肌纤维化,促进DCM 的发展,Yu 等[31]曾报道,miR-185 参与人类B 细胞的激活。后续研究显示,DCM 患者血浆miR-185 的平均水平明显高于健康对照组,而且高表达miR-185 患者的LVEF、左心室舒张末直径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)和脑钠肽前体(N-terminal pro-B type natriuretic peptide,NTproBNP)有显著改善,心血管死亡率和HF 再入院率显著下降,可能与抗β1-肾上腺素能受体(β1-adrenoceptor,β1-AR)抗体和分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的B 细胞水平降低有关[32]。此外,Rubis' 等[33]研究与纤维化相关的miRNA 是否与DCM 的心血管结局相关,发现DCM 与循环冠状动脉旁路移植术患者心肌中的miR-26、miR-29 和miR-133a 表达水平存在差异,而相应的循环和心肌miRNA 之间不相关,循环miRNA 均不是联合终点的预测因子,而心肌miR-133a 却是独立的预测因子。这些研究提示,miRNA可能通过调节炎症和纤维化影响DCM 的预后。

lncRNA 参与心血管疾病的发病机制,因此也可作为DCM 的预后生物标志物。Zhang 等[34]评估循环lncRNA 水平与DCM 患者的HF 严重程度之间的相关性,发现 ENST00000507296 和ENST00000532365 与心脏功能显著相关,并可在至少一种人类心脏源性细胞中检测到二者表达,重要的是,循环ENST00000507296 低水平与DCM 患者的高生存率相关,因此可作为DCM 患者预后的生物标志物。胰岛素样生长因子-1(isulin-like growth factor 1,IGF-1)信号在终末期DCM 中受到抑制,Cheng 等[35]研究分析IGF-1 和HAND2-AS1 水平之间的相关性,发现终末期DCM 患者的血浆IGF-1 和HAND2-AS1 水平明显低于健康对照组,随访研究显示,低水平的IGF-1 或HAND2-AS1 与低生存率具有显著相关,提示HAND2-AS1 可能参与终末期DCM。但是该研究未阐明IGF-1 与HAND2-AS1 之间的关系。总而言之,lncRNA 作为DCM 的预后标志物在调控机制方面仍存在很大的未知空间。

3 ncRNA 作为DCM 治疗靶点的潜力

迄今,关于ncRNA 在DCM 中的作用和机制研究较少,文献报道其主要与心肌细胞死亡、心肌重构和免疫炎症有关(见表2),因此可能作为DCM 治疗的潜在靶点。

表2 ncRNA 在DCM 病理生理中的调控作用Table 2 Regulatory roles of ncRNA in DCM pathophysiology

3.1 ncRNA 对心肌细胞凋亡的影响

DCM 与心源性猝死和HF 有关,但关于DCM 的发病机制仍不明确。Wang 等[36]观察到DCM 患者的心脏组织中存在广泛的纤维化和细胞凋亡,且B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达显著增加,此外,miR-21上调而miR-29 家族(miR-29a、miR-29b 和miR-29c)和miR-133 家族(miR-133a 和miR-133b)下调,表明Bcl-2 和特异性miRNA 可能参与DCM 的发病机制,并可能作为治疗靶点。Calderon-Dominguez 等[37]检测发现缺血性扩张型心肌病(IDCM)患者的血浆miR-16 表达水平上调,进一步在体外实验中证实miR-16 过表达增加心肌细胞凋亡,与其上调蛋白激酶 R 样内质网激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)通路从而诱导内质网应激有关。

lncRNA 的表达水平改变可能影响DCM 的病理进程,然而,其作用的详细机制需要进一步研究。Chen 等[19]曾报道,DCM 患者的 lncRNA AC061961.2 下调。最近,Qiu 等[38]继续研究AC061961.2 对DCM 的影响,发现阿霉素诱导大鼠DCM 模型的心脏组织中细胞凋亡有所增加而AC061961.2 表达减少,进一步研究证实,AC061961.2 通过激活Wnt/β-链蛋白(β-catenin)通路抑制内质网应激介导的DCM 大鼠心肌细胞凋亡。Gabory 等[39]则在同样的DCM 模型中发现,lncRNA H19 在心肌组织中的表达显著上调。Zhang 等[40]在此基础上进一步探讨H19 在阿霉素诱导DCM 中的潜在作用机制,研究结果显示,H19 敲除可降低心肌细胞凋亡,H19/miR-675 轴通过靶向增殖关联蛋白2G4(PA2G4)促进心肌细胞凋亡,该作用机制可为阿霉素诱导DCM 提供了一种新的治疗策略。

以上研究表明miRNA 和lncRNA 均参与调节DCM 心肌细胞凋亡,而且两种ncRNA 之间存在一定联系,因此靶向调节相关信号轴可能比单一靶向具有更好的改善效果。

3.2 ncRNA 对心肌重构的影响

已有研究表明,抑制miR-208a 可以改善HF 小鼠的心脏功能和生存率[41]。Zhou 等[42]应 用miRNA 微阵列分析发现DCM 小鼠和DCM 患者心肌的miR-208b 表达上调,进一步研究其对心脏重构的影响,发现miR-208b 过表达会导致心脏肥厚,ETS 类转录因子则是miR-208b 的潜在靶点,提示miR-208b 在心脏发育和生长中起重要作用。该研究表明,miR-208b 通过转录后基因表达调控参与DCM 的心肌重构过程和发病机制,因此miR-208b可能是DCM 的一个新治疗靶点。此外,Rubis' 等[43]发现外周血中与纤维化相关的miRNA 包括miR-21、miR-26、miR-29、miR-30 和miR-133a 在DCM 患者与对照组之间存在显著差异,但在新发和慢性以及心肌纤维化和非心肌纤维化的DCM 患者中表达相似,其中miR-26 与胞外基质纤维化相关,miR-26和miR-30 与胶原体积分数相关,miR-133a 与细胞外基质代谢相关,miR-26 和miR-133a 与纤维化相关。但是该研究未在细胞或动物实验模型中进一步探讨miRNA 的作用机制。

3.3 ncRNA 对免疫炎症的影响

CD4+T 细胞在DCM 患者中异常激活,可能与该疾病的免疫发病机制有关。Zeng 等[44]研究miRNA 失调是否与DCM 中CD4+T 细胞的激活有关,发现DCM 患者的CD4+T 细胞中miR-451a 水平显著降低,而miR-451a 下调通过靶向转录因子Myc促进DCM 患者的CD4+T 细胞激活和增殖,因此,调控CD4+T 细胞中的miR-451a 表达可能成为一种治疗DCM 的新方法。研究表明,心肌球来源细胞(cardiosphere-derived cells,CDC)能改善生理性单心室患者的心功能和预后,Hirai 等[45]确定CDC 在猪DCM 模型中的安全性和有效性后,在I 期临床试验中进一步评估了CDC 治疗的安全性和对心功能的影响;进一步的机制研究揭示,CDC 改善心功能并减轻心肌纤维化归功于其外泌体携带的miR-146a-5p 可抑制促炎细胞因子,此外,通过转录组学分析鉴定出CDC 来源外泌体中显著富集的miRNA 主要包括miR-126-5p、miR-132、miR-146a-5p、miR-181b、miR-210 和miR-451,提示其可能通过激活内源性心脏修复机制诱导抗纤维化、抗凋亡和促血管生成。

4 总结与展望

不同类型的ncRNA 在DCM 中发挥不同的作用,而且它们之间也存在着相互作用。此外,样本来源不同以及DCM 的复杂病因均可能影响转录组学结果,因此,大样本多中心临床研究和生物大数据分析都是必要的。虽然ncRNA 的作用广泛,但目前关于其影响DCM 发生、进展和转归的机制仍知之甚少。目前关于ncRNA 与DCM 的大多数研究仅停留在转录组学和生物信息学分析阶段,大样本验证及更深入的机制研究不够,目前功能较为明确的多是miRNA,lnRNA 的研究相对较少,而cicRNA 的作用和机制几乎未知。因此,今后的研究应结合临床和生物信息学数据并通过基础研究深入挖掘ncRNA 的作用机制,从而寻找更多有效的潜在标志物和治疗靶点。此外,DCM 的异质性决定该疾病的发病机制极其复杂,在研究ncRNA 的调控机制时需要进一步对该疾病从病因上进行细分。