猪牙皂皂苷脂质体的制备及其黏膜毒性的评价*

赵立敏，陈晓兰，陈 林，彭孟婷，陈 瑶

(贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550002)

中风是现代中医学对急性心脑血管栓塞疾病的一个统称，是一种老年人多发、常见病，早期发病率呈逐年快速增加的趋势。因早期中风发病急、晚期临床治疗难、治疗时间窗口窄，所以中风有发病率高、发病快、死亡率高、致残率高、复发率高、并发症多的六大特征。

猪牙皂来源于豆科植物皂荚(GleditsiasinensisLam.)的干燥不育果实。性温气微、微辛、咸、有小毒，黏膜刺激性大。归属肺、大肠经。猪牙皂主要含有多种三萜皂苷，被收载在2005版《中国药典》，有改善心肌缺血、抗炎、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤[1-7]多种功效。

鼻腔给药祛痰实验和大鼠缺血性脑中风模型[8-9]证明了猪牙皂皂苷经鼻黏膜吸收有显著的祛痰作用，对大鼠缺血性脑中风也有明显的药效作用，充分印证了古人对猪牙皂药性认识的正确性和鼻腔给药的合理性。但在实验中发现猪牙皂皂苷的黏膜毒性非常大，因脂质体有促进吸收、减毒增效、靶向定向作用、药物稳定性高、细胞亲和性大[10-16]等作用。本课题将猪牙皂皂苷制备成脂质体经鼻腔给药以降低猪牙皂皂苷的黏膜毒性。

1 仪器及试剂

表1 仪器及试剂Tab.1 Instruments and reagents

续表1

2 方法与结果

2.1 猪牙皂脂质体中总皂苷的测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取齐墩果酸对照品11.16 mg加入甲醇定容于10 mL容量瓶中，超声溶解备用。

2.1.2 测定波长的确立

取对照品和空白脂质体溶液分别用5%香草醛-冰乙酸溶液与高氯酸显色后在540 nm测定吸光度，结果表明该波长处空白脂质体无干扰，则选540 nm为测定波长。

2.1.3 标准曲线的建立

配制浓度0.03348 mg/mL、0.0558 mg/mL、0.07812 mg/mL、0.12276 mg/mL、0.14508 mg/mL、0.1674 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液，挥干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、1 mL高氯酸。在60 ℃水浴下显色15 min后冷却5 min，加入冰醋酸至刻度，在540 nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标的线性回归方程：a=3.7906c+0.1599，r=0.9995。表明齐墩果酸在0.03348～0.1674 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.4 精密度试验

取对照品浓度为1.106 mg/mL的溶液50 μL，置10 mL容量瓶中，按“2.1.3”项法下连续测定A值6次，以A值计算RSD为0.36%。结果表明该实验精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

精密吸取脂质体溶液0.2 mL，置10 mL容量瓶中定容，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、15 h后按“2.1.3”项下连续测定吸光度，以A值计算RSD为0.47%，说明脂质体在15 h内稳定。

2.1.6 重复性试验

精密量取同一份猪牙皂皂苷脂质体样品6份，每份0.2 mL，照“2.1.3”项下操作分别测定A值，以A值计算RSD为0.49%。结果表明该实验重复性高。

2.1.7 加样回收试验

取空白脂质体6份，分别加入同一浓度的齐墩果酸对照品溶液，照“2.1.3”项操作，分别测定A值，计算回收率为93.5%、91.3%、90.5%、93.0%、93.0%、91.1%。RSD为1.35%。

2.1.8 包封率和载药量的测定

定包封率测定：吸取脂质体溶液5 mL，置于5 mL离心管中高速离心40 min(13000 r/min)，吸取上清液适量，定容至10 mL，照“2.1.3”项操作，分别测定A值。计算包封率，包封率公式为：

包封率=(脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量)×100%=1-介质中未包封的药物量/(脂质体中药物总量+介质中未包封的药量)

同上方法测定载药量：载药量(%)=(脂质体中药物总量-游离药物量)/脂质体取样量总重×100%

2.2 脂质体的制备方法

猪牙皂脂质体制备方法为薄膜分散法：称取实验室自制的猪牙皂皂苷(纯度为36.5%)0.02 g，加15 mL pH为8.0的PBS缓冲液超声溶解5 min后备用，另称量卵磷脂0.2 g，胆固醇0.05 g，用20 mL三氯甲烷溶于250 mL圆底烧瓶，在35 ℃下旋转蒸发至成均匀薄膜，加入猪牙皂皂苷PBS缓冲液混合溶液，在25 ℃条件下水化150 min。照“2.1.8”项测定吸光度，计算并得其包封率。

2.3 脂质体处方及工艺优化

预试验研究发现，药脂质量比(猪牙皂总皂苷和卵磷脂的质量之比)、膜材质量比(卵磷脂和胆固醇的质量值之比)、缓冲液pH值、水化温度等因素对脂质体成膜和水化过程有很大的影响。因此以药脂质量比(A)、膜材比(B)、缓冲液pH值(C)、水化合物温度(D)等因素作为主要因素，以包封率为主要考察指标。照“2.1.8”项法计算包封率。用L9(34)的正交试验设计法对脂质体的制备工艺进行优化。本试验的设计和结果见表2、表3和表4。

表2 正交因素设计表Tab.2 Design of orthogonal factors

表3 L9(34)正交试验设计与结果(n=2)Tab.3 Design and results of L9(34)orthogonalexperiment(n=2)

表4 脂质体制备正交试验方差分析结果Tab.4 Results of variance analysis

由试验表可知，猪牙皂皂苷脂质体包封率影响力排序为C>B>D>A，最佳工艺流程为A2B2C3D3，药物与卵磷脂比为1∶10，卵磷脂与胆固醇的比为4∶1，缓冲液pH值为8.0，水化温度45 ℃。4项因素无显著性。

2.4 验证性试验

据最佳工艺条件，制备3份猪牙皂皂苷脂质体，测定其包封率，包封率为72.67%±0.38%，3次验证试验的结果说明优化工艺合理可行，稳定可靠，重现性好。

2.5 载药量测定

照“2.1.8”项法计算最佳工艺条件下制备的脂质体载药量，载药量为41.8%±0.67%。

2.6 猪牙皂皂苷的质量考查

2.6.1 脂质体粒径和Zeta电位的测定

用贝克曼激光粒径仪测定粒径和Zeta电位。吸取0.1 mL猪牙皂皂苷脂质体稀释至10 mL并测定粒径。猪牙皂总皂苷脂质体粒径均值为(150.11±2.10)nm，猪牙皂皂苷脂质体粒径分布均匀。Zeta电位均值为(-31.70±1.50)mV，表明猪牙皂皂苷脂质体稳定性较好。

2.6.2 脂质体显微镜观察

另取一滴脂质体滴在载玻片上，滴加1滴香柏油后制片在显微镜高倍镜下观察。观察到猪牙皂皂苷脂质体呈圆形。

图1 猪牙皂皂苷脂质体的粒径测定结果Fig.1 Particle size measurement results of the saponin liposome

图2 猪牙皂皂苷脂质体的显微观察结果Fig.2 Microscopic observation of the saponin liposome

2.6.3 脂质体透射电镜观察

透射电镜观察到脂质体为圆形。

图3 猪牙皂皂苷脂质体的透射电镜观察结果Fig.3 Transmission electron microscope observation ofthe saponin liposome

2.7 猪牙皂皂苷脂质体细胞毒性评价

2.7.1 试验步骤

将蟾蜍(50～100 g，采购于蟾蜍养殖合作社)随机分为4组，每组5只。设置为生理盐水组、2%去氧胆酸钠组、猪牙皂皂苷组和猪牙皂皂苷脂质体组。将蟾蜍用锥子破坏运动神经后仰卧固定在解剖板上，用止血钳使蟾蜍嘴巴保持张开状态，每组分别给药0.5 mL溶液涂于上颚，30 min后，取上颚带纤毛的表皮，生理盐水洗净，制片显微镜下观察纤毛运动后，放置在含水的层析缸中，保持湿润。每10 min观察一次纤毛运动，记录全部纤毛运动停止的时间。与生理盐水组比较各组的纤毛运动时间，以评价各组别的黏膜毒性。

表5 粘膜毒性试验结果(X±S，n=5)Tab.5 Mucosal toxicity test results(X±S，n=5)

2.7.2 结果

从表中对比生理盐水组可知，猪牙皂皂苷组纤毛持续运动时间最短，占生理盐水组百分比0.2%；去氧胆酸钠组次之，占生理盐水组百分比26.8%。说明猪牙皂皂苷黏膜毒性最大，去氧胆酸钠组粘膜毒性较猪牙皂皂苷组小。猪牙皂皂苷脂质体组纤毛持续运动时间较长，且占生理盐水组百分比为61.6%。表明猪牙皂皂苷脂质体组黏膜毒性很小。猪牙皂皂苷制备为脂质体以后黏膜毒性减小。

3 结论与讨论

3.1 结论

采用薄膜分散法制备的猪牙皂皂苷脂质体具有可行性高、重复性高、稳定性好等优点，用正交法优化的处方使得猪牙皂皂苷脂质体包封率为72.67%±0.38%，载药量为41.8%±0.67%，电位为(-31.70±1.50)mV，粒径为(150.11±2.10)nm。猪牙皂皂苷脂质体粒径分布较均匀，外形圆整规则，粘膜毒性较小。

3.2 讨论

猪牙皂皂苷有很多的药理作用，猪牙皂皂苷对于治疗缺血性脑中风的效果已经明确，但因粘膜毒性较大未被广泛应用，本课题利用脂质体包载作用，将猪牙皂制成脂质体，以此起到增效减毒的作用，对猪牙皂皂苷的临床应用具有重要的意义，本试验仅对其黏膜毒性进行了考察，接下来将对猪牙皂皂苷脂质体的药效进行研究。