不同剂量六味地黄丸对胰岛素抵抗小鼠糖代谢及体重的影响

陶乐维

(上海中医药大学附属曙光医院内分泌科，上海 201203)

糖尿病发病机制复杂，目前尚不明确，但作为糖尿病基本特征之一且贯穿病程始终的胰岛素抵抗受到极大关注[1]。糖尿病患者的管理非常强调对体重的控制，在改善血糖的同时不增加体重甚至减轻体重[2]。六味地黄丸作为补肾滋阴的代表药，在临床被广泛应用于治疗糖尿病肾阴亏虚证，是从肾论治糖尿病的代表方[3]。目前临床研究和动物实验均证实六味地黄丸能改善胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感性[4-7]。《素问·阴阳应象大论》云：“阳化气，阴成形。”六味地黄丸作为一种补益类中药，在治疗疾病时可以增强体质，促进康复。有文献报道，六味地黄丸降低血糖的同时可增加体重[7-8]，但体重增加是否与六味地黄丸剂量相关，目前尚不明确。

近年来，多项研究表明骨钙素对糖脂代谢有干预作用且与体质量指数呈负相关[9-11]。前期研究发现[12]，针对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠，六味地黄丸小剂量组可更好改善空腹血糖，明显升高未羧化骨钙素(Uncarboxylated osteocalcin，ucOC)、以及ucOC与羧化骨钙素(Carboxylated osteocalcin，cOC)比值水平。因此，采用不同剂量六味地黄丸对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠进行干预，初步探讨不同剂量六味地黄丸在糖代谢与体重增幅之间的关系及与骨钙素的联系，为临床选择合适的用药剂量提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级C57BL/6J雄性小鼠73只购自北京维通利华公司，体重16～18 g，合格证号SCXK(京)2012-0001。小鼠饲养于上海中医药大学动物实验中心，由动物房提供普通饲料，高脂饲料D12492购自Research Diets，由60%脂肪、20%蛋白质、20%碳水化合物组成；平均饲养温度为(23±2)℃、平均湿度为(55±10)%、光照黑暗各12 h，自由进食进水，适应性喂养1周后造模。

1.1.2 实验试剂与仪器：50%葡萄糖(批号1510601，上海信谊药业)，盐酸吡格列酮片(批号178A，日本武田制药)，小鼠高敏胰岛素ELISA试剂盒(Crystalchem公司)，GLA/GLU-Osteocalcin试剂盒(日本Takara株式会社)，血糖仪(德国Roche公司)，血糖试纸(批号474203，罗氏卓越金锐)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验药物：将六味地黄丸(批号150936，仲景宛西制药股份有限公司)放入粉碎机中粉碎，过80目网筛，用蒸馏水定容制成混悬液。将吡格列酮放入蒸馏水中加热，搅拌溶解，制成药物浓度为1 mg/ml的混悬液。

1.2.2 模型的建立、分组与给药：适应性喂养1周后，小鼠体重为18～20 g，按照随机数字表法，将其中61只作为造模组，12只作为正常组。造模组给予高脂饲料喂养，正常组普通饲料喂养，喂养8周后，所有小鼠禁食12 h，然后测量体重，并行腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)。选取造模组符合以下两项标准者进入后续实验：①造模组小鼠体重>正常组体重最大的小鼠；②造模组小鼠IPGTT曲线下面积>正常组小鼠IPGTT曲线下最大面积。最终48只小鼠造模成功，将48只小鼠按体重排序，根据随机数字表法，分为六味地黄丸小剂量组(n=10)、六味地黄丸中剂量组(n=10)、六味地黄丸大剂量组(n=10)、西药组(n=9)、模型组(n=9)。药物干预前测量各组小鼠体重，正常组、模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，西药组给予10 mg/(kg·d)吡格列酮灌胃，六味地黄丸小、中、大剂量组给药剂量分别为1.8、3.6、5.4 g/(kg·d)六味地黄丸灌胃，连续灌胃8周。正常组继续维持普通饲料，六味地黄丸各剂量组、西药组、模型组给予高脂饲料喂养。灌胃第6周行IPGTT；给药第8周测量各组小鼠体重，尾静脉取血测量空腹血糖，留取血清备检。用药期间，六味地黄丸小、中、大剂量组分别有2、3、1只小鼠死亡，西药组2只小鼠死亡。

1.2.3 糖耐量指标：给药6周后晚8点更换垫料，更换饲养笼，禁食，自由饮水，次日早晨8点行IPGTT实验。从尾静脉取血测定空腹血糖，然后以1.5 g/kg葡萄糖腹腔注射，注射葡萄糖后30、60、120 min分别从尾静脉取血检测血糖，计算IPGTT曲线下面积(AUCIPGTT)。AUCIPGTT=[(0 min血糖+30 min血糖)×30/2]+[(30 min血糖+60 min血糖)×30/2]+[(60 min血糖 + 120 min血糖)×60/2][13]。

1.2.4 胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment-insulin Resistance，HOMA-IR)检测：给药第8周检测空腹血糖和胰岛素水平，计算HOMA-IR。HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

1.2.5 骨钙素检测：取备检血清，采用ELISA法检测ucOC、cOC水平，并计算ucOC与cOC比值。

2 结 果

2.1 各组小鼠IPGTT及AUCIPGTT比较 见表1。与正常组比较，模型组各时间点血糖水平及AUCIPGTT均升高(P<0.01)。与模型组比较，六味地黄丸小剂量组各时间点血糖水平、AUCIPGTT均降低(P<0.05)，六味地黄丸中剂量组30 min血糖、AUCIPGTT均降低(P<0.05)，六味地黄丸大剂量组0、60 min血糖水平及AUCIPGTT均降低(P<0.05)。与六味地黄丸小剂量组比较，六味地黄丸中剂量组0 min血糖水平明显升高，六味地黄丸大剂量组0、30 min血糖水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与六味地黄丸中剂量组比较，六味地黄丸大剂量组30 min血糖升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组小鼠IPGTT及AUCIPGTT比较

2.2 各组小鼠HOMA-IR比较 见表2。与正常组比较，模型组HOMA-IR升高(P<0.01)；与模型组比较，六味地黄丸小、大剂量组HOMA-IR均降低(P<0.01)。与模型组比较，六味地黄丸中剂量组HOMA-IR降低，差异无统计学意义(P>0.05)。六味地黄丸各组间比较，六味地黄丸小剂量组HOMA-IR低于六味地黄丸中剂量组(P<0.01)。六味地黄丸小剂量组与六味地黄丸大剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，六味地黄丸中剂量组与六味地黄丸大剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组小鼠体重增幅比较 见表2。模型组体重增幅高于正常组(P<0.01)。六味地黄丸小剂量组体重增幅小于模型组，六味地黄丸中剂量组体重增幅高于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。六味地黄丸大剂量组体重增幅与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。六味地黄丸各组间比较，六味地黄丸小剂量组体重增幅小于六味地黄丸中剂量组、六味地黄丸大剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。六味地黄丸中剂量组体重增幅与六味地黄丸大剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠HOMA-IR及体重增幅比较

2.4 相关性分析 见图1。体重增幅与HOMA-IR呈正相关(r=0.711，P=0.000)；体重增幅与ucOC/cOC呈负相关(r=-0.387，P=0.005)，但与ucOC无相关性(r=-0.141，P=0.324)；HOMA-IR与ucOC/cOC呈负相关(r=-0.358，P=0.010)，但与ucOC无相关性(r=-0.156,P=0.274)。

图1 各指标相关性分析

3 讨 论

六味地黄丸出自钱乙《小儿药证直诀》，全方由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、丹皮组成，三补三泻。近年来六味地黄丸被广泛用于治疗糖尿病肾阴亏虚证，具有改善血糖、改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性的作用。一项针对自发性2型糖尿病模型小鼠的研究采用了六味地黄丸两个剂量组进行干预，结果发现小剂量组改善血糖优于大剂量组，同时小剂量组改善胰岛素抵抗优于大剂量组[14]，这与本研究结果有相似之处。本研究结果显示，在体重增幅方面，六味地黄丸小剂量组<六味地黄丸大剂量组<六味地黄丸中剂量组，而HOMA-IR与之相反。BMI与胰岛素抵抗呈正相关，BMI越大胰岛素抵抗越严重[15]。因此，减轻体重对胰岛素抵抗患者意义深远重大，临床应用如胰岛素[16]、磺脲类药物[17]等降糖药物时应注意其对体重的影响。研究发现，六味地黄丸小剂量组对自发性糖尿病模型小鼠体重增幅明显小于大剂量组[14]。一项关于STZ糖尿病大鼠研究发现，六味地黄丸小剂量组体重增幅小于大剂量组[18]。本研究结果显示，六味地黄丸小剂量组的体重增幅明显小于六味地黄丸中剂量组和大剂量组。同时，六味地黄丸小剂量组对糖耐量和胰岛素抵抗的改善作用在各剂量组中最好。相关性分析发现体重增幅与HOMA-IR存在明显正相关，再次证明体重与胰岛素抵抗之间有着极为密切的联系。

骨骼是一种内分泌器官，来源于成骨细胞的骨钙素，由于在其未羧化状态下具有改善糖脂代谢的作用而受到广泛关注[9-10]。有研究显示，骨钙素基因敲除小鼠表现为肥胖，而骨钙素基因增强小鼠表现为消瘦[19]。但有基础研究发现，ucOC与总骨钙素的比值较ucOC对代谢表型的解释更可靠[20]。本研究相关性分析结果显示体重增幅与ucOC无明显相关性，但与ucOC/cOC呈负相关。课题组前期研究同样发现，ucOC/cOC较ucOC可更好地解释六味地黄丸对糖代谢指标的改善作用，同时发现ucOC/cOC与糖代谢指标相关性更高[12]。提示不同剂量六味地黄丸对胰岛素抵抗小鼠体重的作用受ucOC与cOC的共同作用，这可能与骨钙素对脂肪组织的调控相关[20]，但其具体机制需要进一步深入研究。