冯 亮,樊 力
(陕西省核工业二一五医院手足外科,陕西 咸阳 712000)
皮瓣是一类复合组织块,包括由皮肤、皮下组织、深层次组织、血供组织等[1]。皮瓣移植是临床上修复重建常用的方法,是将皮瓣由身体一处转移至另一处的过程,也是临床上修复组织缺损和器官再造的重要方法[2-3]。但由于各种因素的影响,很多患者的皮瓣修复过程中容易出现皮瓣部分或全部坏死,甚或出现皮瓣缺血再灌注损伤导致的皮瓣部分或全部坏死,导致皮瓣修复失败[4]。皮瓣类型多种多样,随意型皮瓣属于其中之一,其特点是使用灵活和简单快捷等。随意型皮瓣不含轴型血管,血供仅靠皮下的毛细血管网,在修复中的成活率比较低[5-6]。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)存在于成人的骨髓组织中,具有多向分化潜能,也能够能够自我复制,能够分化为同为中胚层的成骨细胞、软骨细胞等,提示在皮瓣修复中可能存在重要的价值[7-8]。研究[9]表明BMSCs除能分化为多种参与血管形成的细胞外,还能分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等因子,从而促进血管再生,改善局部血供。本研究通过动物实验探讨BMSCs通过增加血管生成和VEGF表达影响大鼠随意型皮瓣存活的效果,以促进BMSCs的应用。
1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠(48只)购自西安交通大学实验动物中心,2~3月龄,体重200~250 g,许可证号:SYXK(陕)2020-005。严格遵守相关标准进行饲养,定量喂食,自由饮水,无其他不良因素。本研究得到了本院动物伦理委员会的批准。所有动物在实验过程中都符合伦理原则。
1.2 细胞与主要试剂 大鼠BMSCs来自本院实验室。丙二醛(MDA)含量检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号分别为S0131S、S0109、P0012S)均购自上海碧云天生物科技有限公司;VEGF单克隆抗体、山羊抗鼠多克隆抗体(批号分别为ab32152、ab150113)均购自英国Abcam公司;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM细胞培养液(批号分别为S9020、T8150、31600)均购自Solarbio公司。
1.3 大鼠随意型皮瓣模型的建立 所有大鼠适应性饲养1周,适应实验室环境后开始进行实验。将大鼠置于俯卧位,固定在手术台上,腹腔注射10.0%水合氯醛3.0 ml/kg。将其背部剪毛、脱毛后用碘伏消毒,铺巾。将大鼠背部两髂嵴连线处作为蒂,于背部正中采用甲紫设计矩形随意皮瓣(3 cm×9 cm),沿设计线切开皮肤和皮下组织,保留真皮下毛细血管网,达深筋膜浅层。结扎创面较活跃出血点,蒂在尾侧,距尾端约1.5 cm,完全掀起皮瓣后止血。间断原位缝合,用聚维酮碘消毒切口周围后涂抹抗生素软膏。采用头颈固定器固定大鼠,使大鼠不能破坏皮瓣模。
1.4 动物分组与处理 将随意型皮瓣模型大鼠随机平分为模型组、小剂量BMSCs组和大剂量BMSCs组。模型组在背部肌肉深筋膜8个不同点(每个点相隔1 cm左右)注射0.4 ml磷酸盐缓冲液,小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组于相同部位注射等体积的BMSCs完全培养液(细胞浓度分别为2×108个/L和20×108个/L)。BMSCs用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养,采用磷酸盐缓冲液重悬。三组均每2 d注射1次,持续28 d。
1.5 观察指标 ①观察与记录所有大鼠的随意型皮瓣形态,包括皮瓣颜色、质地、组织弹性、坏死面积等。采用数码相机进行皮瓣摄像,精确测量皮瓣存活部分及坏死部分面积。皮瓣坏死标准:病理表现为组织回缩、组织崩解、细胞核消失,弹性差,质地坚硬,切割组织不出血,炎症细胞广泛浸润,皮瓣颜色发黑。皮瓣存活率=皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100.0%。②取皮瓣远端标本(在成活区距成活与坏死交界处0.5 cm),制成10.0%水相组织匀浆,2000 r/min离心10 min,取上清液置于4 ℃冰箱,采用相应试剂盒检测上清液中SOD和MDA水平。③取大鼠尾静脉血1 ml,2000 r/min离心10 min(离心温度为4 ℃),用酶联免疫法检测血清基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质细胞衍生因子-1(SDF-1)水平。④在治疗第28、56天各组分别处死8只大鼠,将随意型皮瓣样本置于干冰上,剪碎后使用电动匀浆器进行组织匀浆,裂解蛋白后于4 ℃条件下10000 r/min离心5 min,收集上清。蛋白浓度测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行:取20 μg蛋白进行蛋白电泳,湿法转膜,用溶解有5%脱脂奶粉的洗膜缓冲液(TBST)封闭1 h;加入VEGF一抗,4 ℃孵育过夜;TBST洗膜(3次)后加入二抗,室温反应1 h;TBST洗膜(3次),进行蛋白曝光显色分析。
2.1 三组大鼠皮瓣存活率比较 见表1。小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的皮瓣存活率高于模型组,且大剂量BMSCs组皮瓣存活率高于小剂量BMSCs组(均P<0.05)。
表1 三组大鼠皮瓣存活率比较(%)
2.2 三组大鼠皮瓣SOD和MDA水平比较 见表2。小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的皮瓣SOD水平高于模型组,MDA水平低于模型组(均P<0.05)。小剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的皮瓣SOD水平低于大剂量BMSCs组,MDA水平高于大剂量BMSCs组(均P<0.05)。
表2 三组大鼠皮瓣SOD和MDA水平比较
2.3 三组大鼠血清MMP-9与SDF-1水平比较 见表3。小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的血清MMP-9与SDF-1水平高于模型组,且大剂量BMSCs组MMP-9与SDF-1水平高于小剂量BMSCs组(均P<0.05)。
表3 三组大鼠血清MMP-9与SDF-1水平比较(pg/ml)
2.4 三组大鼠皮瓣VEGF蛋白相对表达量比较 见表4。小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第28、56天的皮瓣VEGF蛋白相对表达量高于模型组,且大剂量BMSCs组VEGF蛋白相对表达量高于小剂量BMSCs组(均P<0.05)。
表4 三组大鼠皮瓣VEGF蛋白相对表达量比较
皮肤移植是修复大面积皮肤缺损的常见方法,皮瓣组成包括皮肤和附着皮下组织,与本体相连的部分为皮瓣蒂部[10-14]。随意皮瓣的长宽比在1∶1至3∶1之间,不受限于轴心血管走形和分布。随意皮瓣的纵轴线方向与设计部位比较灵活多样,操作相对简便,但临床上容易发生缺血坏死[15]。本研究显示,小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的皮瓣存活率高于模型组,且大剂量BMSCs组皮瓣存活率高于小剂量BMSCs组,表明BMSCs可提高大鼠随意型皮瓣存活率。从机制上分析,BMSCs是来源于中胚层的干细胞,具有多向分化能力,可在具体损伤反应中大量分泌生长因子,从而促进各种病损的组织器官修复。研究[16]显示BMSCs具有多向分化潜能,是组织修复的良好种子细胞,可以向其他胚层来源的细胞分化,能够有效提高股骨头内局部组织的成骨能力。研究[17]显示BMSCs能分泌多种成骨活性因子,有利于骨折愈合时细胞爬行,以减低骨内压,达到提高骨折愈合率的效果。影响皮瓣存活率的因素比较多,包括能量代谢障碍、血管内皮细胞功能障碍、自由基生成增多、钙超载、细胞凋亡等[18]。MDA水平既能直接反映机体脂质过氧化的速率、强度,还可间接反映细胞受损情况。SOD是体内天然的抗氧化酶,也是机体抗氧化酶系统重要的抗氧化剂之一,可通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应维持机体自由基的动态平衡,避免损伤机体的组织细胞[19]。本研究显示,小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的皮瓣SOD水平高于模型组,MDA水平低于模型组,且小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组两指标水平比较差异有统计学意义,表明BMSCs可提高大鼠的皮瓣SOD水平,降低MDA水平。研究[20]表明BMSCs分泌的基质细胞衍生因子可促进血管生成、上皮再生,从而促进小鼠放射伤口愈合及皮肤血管增生,进一步改善皮肤的修复质量。同时,BMSCs具有免疫调节作用,采集和扩增均较为方便,在临床上的应用具有很好的推广价值。
MMP-9是一种肽链内切酶,其可以降解细胞外基质,提高细胞因子的生物利用度,促进内皮祖细胞从骨髓中释放至外周血[21]。SDF-1可介导机体的血管生产过程,增加缺血心肌组织SDF-1的表达,促进内皮祖细胞至缺血的心肌参与血管生成[22]。本研究显示,小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第7、14、28天的血清MMP-9与SDF-1水平高于模型组,且大剂量BMSCs组两指标水平高于小剂量BMSCs组,表明BMSCs可提高大鼠血清MMP-9与SDF-1水平。研究[23]显示,BMSCs能够促进大鼠骨髓中内皮祖细胞的动员释放,有利于外周血血管内皮祖细胞参与缺血组织血管形成,从而提高随意皮瓣的存活率。
VEGF能够直接诱导血管内皮细胞增生,也具有增加血管通透性等作用,还可以通过促进血浆蛋白在局部沉积为组织再生和新生血管长入提供细胞外基质,能促进局部微循环血管网的建立,促进成骨细胞的生长,诱导成骨细胞向坏死区转移[24-25]。VEGF还可以促进血管内皮细胞分裂及抑制其凋亡,减轻皮瓣缺血再灌注损伤,有利于皮瓣形成新生血管和缺血皮瓣的再血管化,从而促进皮瓣成活[26]。本研究显示,小剂量BMSCs组与大剂量BMSCs组治疗第28、56天的皮瓣VEGF蛋白相对表达量高于模型组,且大剂量BMSCs组VEGF蛋白相对表达量高于小剂量BMSCs组。从机制上分析,VEGF能促进已存在的血管出芽生长,缓解皮瓣组织水肿,减少炎性细胞浸润,增强皮瓣抗感染能力。BMSCs能够提高自由基清除酶的活性,增强抗氧化能力,还能在损伤局部反应性分泌VEGF,通过自身分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞改善缺血缺氧状态,直接生成新的血管来供应缺血部位,减轻氧化应激[27]。
综上所述,BMSCs可提高大鼠血清MMP-9与SDF-1水平,增加皮瓣SOD水平,降低MDA水平,有利于提高VEGF的表达,从而增加随意型皮瓣存活率。但研究也存在一定的不足,没有进行细胞学分析,也没有纳入空白对照组,将在后续研究中进一步探讨。