蜜蜂细胞色素P450的研究进展

苏 蓓,杲款款,王瑞明,杨晓慧

齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,山东 济南 250353

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP),是最大的基因家族之一,在所有生物中几乎都有P450基因。随着越来越多的P450序列被发现,P450酶在越来越多的生理过程中的作用也逐渐得到证明。人类基因组携带大约57个CYP基因；在昆虫基因组中,从最少的体虱Pediculus humanus[1]携带36个CYP基因到最多的蚊类mosquito携带170个CYP基因[2]。每个P450蛋白都是一个P450基因的表达产物,而P450的多样性是连续的基因(或基因组)复制和序列差异的结果。

1982年,大鼠P450基因(CYP2B1)实现了第一次克隆和测序[3]；1989年,昆虫P450基因(家蝇CYP6A1)也被克隆和测序[4]。可溶性细菌P450的第一个晶体结构,P450cam,发表于1985年[5]；2000年,第一个哺乳动物微粒体P450的结构被发现[6]。1994年家蝇CYP6A1实现了异源表达,这一进步为我们研究单个P450酶奠定了基础。2000年果蝇基因组的测序成功,揭示了昆虫P450序列的特点[7-8]。由于P450酶在蜜蜂中脂肪酸代谢过程中起到关键作用,因此近几年细胞色素P450酶在蜜蜂上的研究也成为一大热点。

1 细胞色素P450酶概述

1.1 结构和功能特点

45-55kda P450蛋白的基本共同特征是它们的FeII-CO配合物在450 nm附近具有吸光度峰,它们因此被命名[9]。P450酶以其单加氧酶的作用而闻名,它能够催化氧分子的一个氧原子向底物转移,并将另一个氧原子还原成水。

但是,氧原子转移并不是P450酶的唯一催化功能。它们还表现出氧化酶、还原酶、去饱和酶、异构酶等活性。并且已知共同催化至少60种不同的化学反应[10]。

大多数动物细胞色素P450依赖氧化还原伴侣提供还原当量。一些细菌和真菌P450酶是具有多种氧化还原伴侣的融合蛋白,而一些P450酶直接作用于它们的底物,不需要双氧或还原等价物[11]。

1.2 催化机制

氧化后的P450是两种形式的混合物:以水为第六配位体的低自旋(FeⅢ)在硫代Cys配体的对面形成和一个高自旋(FeⅡ)的五配位形式。基底结合将水从第六个连接位置置换,导致向高自旋方向转移。这种转移是可以观察到的(I型光谱),并且伴随着P450氧化还原电位的降低,P450-底物复合物从氧化还原伴侣(P450还原酶或肾上腺素)接收第一个电子,然后亚铁P450(FeⅡ)结合O2。在这一步骤中,CO可以和O2竞争与P450的结合。其结合形成稳定的络合物,该络合物在催化上不活跃。在450 nm的光照下,CO可以被置换。然后,P450-O2-底物复合物接受第二个电子(来自P450还原酶或在某些情况下来自细胞色素b5,或来自肾上腺素)以形成过氧化铁阴离子。在经过质子化后,铁氢过氧化物络合物引发活性氧形式的酶发挥作用。近年来,对一种关键中间体化合物I(通过类比过氧化物酶化合物I)进行了表征。这种中间产物是一种具有非定域氧化当量的铁(Ⅳ)氧杂化合物[12]。因此,未活化的C—H键的羟基化反应遵循“反弹”机制,其中氢被化合物Ⅰ从底物中抽离,形成氢氧化铁,然后迅速与底物自由基结合。

2 蜜蜂细胞色素P450基因的种类多样性

目前,蜜蜂基因组已经被发现包含46个P450基因,表1列出了部分已经克隆的蜜蜂P450基因。

表1 部分已克隆的蜜蜂P450基因

蜜蜂基因组中的P450基因可以分出四个不同的进化支系:线粒体P450s,以及以这些分支中重要的脊椎动物成员命名的CYP2、CYP3和CYP4分支。在昆虫的CYP3分支中,人类的CYP3A4是最著名的成员,包括庞大的CYP6和CYP9支系[13]。在双翅目昆虫群中,CYP3和CYP4分支都很丰富,各占其P450总体的40%左右。CYP2进化支系在昆虫中由多种单一成员组成,在蜜蜂中仅有8个基因,在果蝇和蚊类中分别有 6个和10个。线粒体P450的数量因CYP12序列的完全缺失而显著减少。蜜蜂P450基因仅有46个,蜜蜂P450基因数量较少的主要原因是CYP4的数量严重不足(仅4个序列)[14]。

蜜蜂中的四种CYP4s虽然在序列特征上与其他昆虫相似,但这四种CYP4s具有什么特定功能还未被发现。CYP4G11是第一个已知的来自蜜蜂的P450序列[15],在果蝇Drosophila和冈比亚按蚊An.gambiae中也发现了许多功能同源物,如果蝇中的CYP4G1[7]和CYP4G15、按蚊中的CYP4G16和CYP4G17。CYP4G11基因在工蜂中的表达高于蜂王。昆虫的CYP4G成员有着非传统的N末端序列,这表明蛋白质具有不寻常的亚细胞分布,这可能与它们的功能有关。CYP4AV1和CYP4AZ1[15]基因与火蚁Solenopsisinvicta脂质代谢相关的CYP4AB1和CYP4AB2类似[16]。

3 蜜蜂细胞色素P450基因的功能多样性

3.1 参与蜕皮激素的合成

一些细胞色素P450基因涉及蜕皮激素或蜕皮类固醇的生物合成、活化和分解代谢。这些基因是昆虫中最保守的P450基因之一,他们属于CYP2族(CYP307、CYP306、CYP18)和线粒体CYP家族(CYP302、CYP314、CYP315)。微粒体C-25羟化酶被鉴定为CYP306A1,在家蚕和果蝇中属于CYP2族的P450酶。在家蚕中,胸腺转录组的微阵列分析和差异显示CYP306A1主要在胸腺中表达,并且在蜕皮类固醇产生时高表达。

蜕皮激素是参与昆虫胆固醇骨架合成的重要激素,因此关于P450在蜕皮激素合成中的作用有很多相关研究。有研究发现CYP307、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1和CYP314A1是参与合成果蝇蜕皮激素的主要P450酶；另外有研究还发现P450也参与蜕皮激素的降解代谢,主要负责催化第26位碳的羟基化步骤[17]。

由于参与合成内源性物质的功能酶基因序列一般倾向于保守,利用生物学分析,通过对比果蝇与蜜蜂在序列上的相似性,认为西方蜜蜂的CYP307B1、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1和CYP314A1参与蜜蜂蜕皮激素的合成[17-18]。

3.2 参与保幼激素的合成与代谢

保幼激素(juvenile hormone,JH)代谢的研究长期以来一直由酯酶和环氧化物水解酶为主,但对家蝇抗杀虫剂菌株的早期研究表明其在氧化代谢中也发挥作用。有研究表明家蝇CYP6A1能够有效代谢倍半萜类化合物,证实了这些早期研究。因此,JHs的羟基化和环氧化证实了P450介导的这些激素的代谢途径。

在蜜蜂中,蜂王上颚腺合成蜂王信息素,而工蜂上颚腺则合成蜂王浆中最主要的成分即不饱和脂肪酸10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)。10-HDA不仅是蜜蜂食物中最重要的抑菌成分,同时它还是影响雌性蜜蜂级型分化的重要活性物质之一。保幼激素(juvenile hormone,JH)是昆虫体内最重要的激素之一,对蜜蜂幼虫的生长发育,级型分化,成蜂的社会分工与行为发育,腺体发育都有广泛的影响[19]。由于意蜂工蜂血淋巴内的JHIII含量与上颚腺分泌的10-HDA含量有显著的正相关关系,实验证实在合成10-HDA过程中,硬脂酸首先发生ω位或ω-1位羟基化,并且这一反应是由细胞色素P450氧化酶催化的单加氧反应。因此推测蜜蜂P450与保幼激素的合成与代谢相关联[20]。

3.3 杀虫剂的诱导表达及代谢

P450基因表达水平的变化可能足以改变体内酶激活和失活之间的平衡[21]。例如,家蝇Akita-f品系的抗性与腹部微粒体中氧化酯裂解增加有关。螺旋病毒NC-86菌株的总P450水平保持不变,与一组具有高脱硫活性的P450酶被一组代谢较少对硫磷的P450酶取代有关,并具有较低的脱硫/氧化酯裂解比[22]。

Toshiyuki Fujita等人利用蛋白质组学方法鉴定了CYP6AS3、CYP6AS4、CYP6AS5、CYP6AS7、CYP6AS8、CYP6AS11、CYP6BD1、CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、CYP336A1、CYP305D1、CYP315A1这14个P450酶,其中CYP6SA3和CYP6AS4被鉴定为“postcerebral glands(PcGs)选择性”蛋白。这两种CYP450基因都有代谢槲皮素的功能[23-24],槲皮素是蜂蜜中的一种植物化学成分。另外CYP6AS5、CYP6AS8、CYP6AS11、CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP305D1、CYP315A1八个基因为“上颚腺选择性”蛋白,其中CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3参与蜂箱杀螨剂和槲皮素的解毒代谢[23],CYP315Al是一种被广泛研究的蜕皮甾体生物合成酶,CYP6AS8、CYP6AS11、CYP305D1的功能尚不清楚[25]。

为了探究P450在中华蜜蜂(Apisceranacerana)解毒中的分子机制,有研究分离并鉴定了4个新的P450基因(Acc301A1、Acc303A1、Acc306A1和Acc315A1)。研究发现将Acc301A1、Acc303A1和Acc306A1基因利用RNA干扰技术敲除后,能够显著提高杀虫剂处理后中华蜜蜂的死亡率。这个结果为研究四种P450基因在解毒中的作用提供了重要证据[26]。

3.4 上颚腺分泌物的合成

P450催化的脂肪酸ω位和ω-1位羟基化已经在昆虫中被报道[22]。重组CYP4C7、CYP6A1和CYP12A1大肠菌株缺乏月桂酸羟化酶活性,但果蝇CYP6A8被证明可以催化月桂酸ω-1位羟基化,这表明脂肪酸羟化酶活性不限于CYP4家族的P450。

因蜜蜂具有种姓特异性信息素表达的特点,Malka等[27]研究发现意大利蜜蜂基因组中的CYP4AA1和CYP18A1可能分别参与代谢脂肪酸ω位和ω-1位羟基化；他们通过生物信息学分析了两种候选基因CYP4AA1和CYP18A1,研究了它们在蜂王以及工蜂上颚腺中的表达,实时荧光定量PCR结果显示CYP4AA1在有无蜂王的工蜂群中均高水平表达,而在蜂王中的表达可以忽略不计。CYP18A1基因则在蜂王上颚腺中表达水平很高,在无蜂王工蜂群的上颚腺中可以忽略不计。但有蜂王的工蜂群CYP18A1的表达明显高于无蜂王工蜂群。为CYP4AA1和CYP18A1蛋白构建三维结构模型,发现这两个P450基因之间的活性位点存在差异,这与其具有不同的催化特异性一致。这一结果表明,CYP4A和CYP2E1这两个P450亚家族可能分别参与代谢脂肪酸ω位和ω-1位的羟基化[17]。

10-HDA是蜜蜂上颚腺分泌的一种重要的信息素,Erika Plettner等人推测在蜜蜂体内P450s能够氧化合成 10-HDA中10号碳位的羟基。吴雨祺等人研究鉴定了46个与蜜蜂上颚腺中10-HDA生物合成相关的候选基因,其中包括细胞色素P450 家族成员及脂肪酸代谢β氧化和ω氧化过程中的相关P450基因[28]。并使用qPCR技术研究发现CYP6AS8基因是蜜蜂上颚腺合成10-HDA的一个关键酶[29]。武雪龙等实验前期利用比较蛋白质组学的方法对10-HDA 分泌量差异显著的蜜蜂上颚腺差异蛋白进行了分离和鉴定,并结合生物信息学技术筛选出在10-HDA 高产时高表达的蛋白CYP49A1及CYP9e2,实验最终发现蛋白CYP49A1可将十二烷末端氧化为羟基,产生十二碳一元醇；CYP9e2可催化底物癸酸发生氧化反应,得到最终产物为2-羟基癸二酸[30]。

4 总结与展望

细胞色素P450作为最大的基因家族中的一员,具有丰富的生物多样性。本文主要介绍了蜜蜂中细胞色素P450基因在种类上的多样性,以及其在蜕皮激素合成、保幼激素合成与代谢、杀虫剂的诱导表达与代谢和蜜蜂上颚腺分泌物的合成等功能上的多样性。目前针对蜜蜂P450的研究相对于其他昆虫还比较少,但随着分子生物学的发展以及组学研究在基因筛选及表达上的广泛应用,许多蜜蜂细胞色素P450基因的功能也被慢慢发现。

10-HDA在自然界中主要来自蜜蜂工蜂上颚腺分泌,在蜜蜂体内合成10-HDA途径中,P450s基因在脂肪酸羟基化过程中起到关键作用,涉及蜜蜂上颚腺10-HDA的生物合成,所以越来越多的研究集中到合成10-HDA过程中关键P450基因的筛选与鉴定。因此明确该过程中关键的P450基因,对了解蜜蜂细胞色素P450基因的功能和探究蜜蜂10-HDA合成途径具有重要意义,也对探究在体外合成10-HDA路径具有实践意义。