单宁对绵羊抗氧化能力及免疫性能的影响

解湧芳，李大彪，牛晓雨，朱寿谦，王敬尧，丽 丽

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区高校动物营养与饲料科学重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

柠条在内蒙古、陕西等地分布广泛，起到防风固沙和保持水土的作用，营养价值较高，但其含有单宁，限制了柠条的开发利用。单宁广泛存在于水果、豆类、灌木类等植物中，是植物由碳水化合物代谢衍生出来的具有保护性的物质。饲粮中适量的单宁不仅能提高反刍动物过瘤胃蛋白和氨基酸的数量，还可抑制臌胀病发生，提高动物生产性能。单宁分子中含有大量的羟基和羰基，是较强的抗氧化剂和活性氧自由基清除剂。陈赛娟等研究发现在獭兔饲粮中添加适量的单宁酸可以增强抗氧化和免疫能力。Holdеrnеss 等研究发现，知母宁与螺旋藻的抗氧化作用强于单宁酸，而知母宁和单宁酸的清除自由基作用强于螺旋藻。金亚倩等在绵羊饲粮中添加葡萄皮渣（含单宁），结果表明适宜剂量的葡萄皮渣可提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性和总抗氧化能力（T-AOC），降低丙二醛（MDA）含量。目前，国内外关于单宁对动物抗氧化和免疫能力影响的报道大多以葡萄皮渣、茶叶渣等副产物为研究对象，而木本化饲料资源柠条来源的单宁对反刍动物抗氧化和免疫性能的研究报道较少。本课题组前期研究发现饲粮中含有2%和4%的单宁对绵羊的日增重无显著影响，本试验旨在研究饲粮中不同水平单宁对绵羊免疫及抗氧性能的影响，为柠条等富含单宁的非常规饲料资源的开发利用，以及单宁在畜牧业生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验选用结荚期的柠条作为饲粮单宁的来源，柠条购自内蒙古百瑞草业有限公司。

1.2 试验设计及日粮 试验选取15 只健康状况良好、体重为45 kg 左右、1～1.5 周岁杜蒙杂交羯羊，随机分为3 组，每组5 只。对照组饲粮中不含单宁，2%单宁组饲粮中单宁含量为2%，4% 单宁组饲粮中单宁含量为4%。试验动物按照维持需要的1.2 倍饲养，按照《动物营养参数与饲养标准》（2010）配制饲粮。主要化学成分详见表2，参照王敬尧（2019）的方法测定。预饲期14 d，正试期75 d。试验动物单笼饲养，自由饮水，试验开始前统一驱虫。每天09:00 和17:00 各饲喂1 次。3 组饲粮按照等能等氮原则配制，饲粮精粗比4:6，加工成全混合颗粒。饲粮组成及营养成分见表2。

表1 柠条中的营养成分和单宁含量（风干基础）

表2 试验饲粮组成和营养成分（干物质基础）

1.3 样品采集 在正试期第15 天、第45 天和第75 天晨饲前，用真空采血管对每只羊进行颈静脉采血。用无抗凝采血管和抗凝采血管分别采集10～20 mL 血液，倾斜静置30 min 后，3 500 r/min 离 心10 min。吸取无抗凝采血管离心后的上清液，制备血清，用于血清免疫及抗氧化指标的测定；吸取抗凝采血管离心后的血清和血浆之间的淋巴细胞，放于冻存管中，加1 mL 裂解液混匀后然后暂存于液氮中，之后放置于-80℃冰箱冷冻保存，用于抗氧化及免疫相关基因表达量的测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 血清抗氧化指标测定 MDA、T-AOC、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、T-SOD、过氧化氢酶（CAT）、硫氧还原蛋白酶（TrxR）活性的测定参照试剂盒说明书进行，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。测定仪器为分光光度计（1900PCS）和全功能酶标仪（EL-X800，Bio-TEK）。

1.4.2 血清免疫指标测定 免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM） 、白介素-1（）、白介素-6（）、肿瘤坏死因子-（-）含量采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定，参照试剂盒说明书的步骤进行，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。测定仪器为分光光度计（1900PCS）和全功能酶标仪（EL-X800，Bio-TEK）。

1.4.3 血清淋巴细胞中抗氧化及免疫相关基因表达量的测定 用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，采用Trizol 试剂盒（TaKaRa）从淋巴细胞提取总RNA，并测定总RNA 的纯度 和浓度。用Primе ScriptRT 试剂试剂盒将总RNA 反转录为cDNA ；步骤为：37℃、15 min ；85℃、5 s，并保存于-80℃用于实时荧光定量PCR。采用SYBR Grееn II 实时定量RT-qPCR 技术对绵羊血液淋巴细胞中、核转录因子-B（）、、转录因子NFE2 相关因子（）等基因的相对表达量进行测定，以作为内参基因。各基因表达量用2值表示，同一基因平行测定3 次。目的基因和内参基因的引物序列见表3。

表3 基因及引物序列

1.5 统计分析 试验数据经Excеl 2013 进行初步整理，实时荧光定量PCR 的试验结果采用2法进行相对定量分析，运用SAS 9.2 软件的ANOVA 过程进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan′s 法。以<0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 单宁对绵羊血清抗氧化指标的影响 由表4 可知，正试期第15 天，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊血清T-SOD、TrxR 和GSH-Px 浓度高于对照组（<0.05）；2%单宁组和4%单宁组绵羊血清T-AOC 有高于对照组的趋势（=0.060），而血清MDA 含量有低于对照组的趋势（=0.041）；2% 单宁组绵羊血清CAT 浓度高于对照组和4%单宁组（<0.05）。

表4 柠条中的单宁对绵羊血清抗氧化指标的影响

第45 天，2% 单宁组 和4% 单宁组 绵羊血 清CAT、T-SOD 和GSH-Px 浓度高于对照组（<0.05）；2% 单宁组绵羊血清T-AOC 高于对照组和4% 单宁组（<0.05），而MDA 含量低于对照组和4% 单宁组（<0.05）；3 组绵羊血清TrxR 浓度无显著差异。

第75 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊血清CAT、TrxR 和GSH-Px 浓高于对照组（<0.05）；2%单宁组绵羊血清T-AOC 有高于对照组的趋势（=0.101），而MDA 含量低于对照组和4%单宁组（<0.05）；4%单宁组绵羊血清T-SOD 浓度高于对照组和2% 单宁组（<0.05）。

2.2 单宁对绵羊血清免疫指标的影响 由表5 可知，正试期第15 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊血清IgG 浓度高于对照组（<0.05），IL-1和IL-6 浓度低于对照组（<0.05）；2% 单宁组和4% 单宁组血清TNF-浓度有低于对照组的趋势（=0.051）；2%单宁组绵羊血清IgM 浓度高于对照组和4%单宁组（<0.05）；3 组绵羊血清IgA 浓度无显著差异（>0.05）。

表5 柠条中的单宁对绵羊血清免疫指标的影响

正试期第45 天，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊血清IgA 和IgG 浓 度高于对照组（<0.05），IL-1和TNF-浓度低于对照组（<0.05）；3 组绵羊血清IgM和IL-6 浓度无显著差异。

正试期第 75 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊血清IgG 浓度高于对照组（<0.05）；2% 单宁组和4% 单宁组绵羊血清IgA 浓度有高于对照组的趋势（=0.042），而TNF-浓度有低于对照组的趋势（=0.053）；3 组绵羊血清IgM、IL-1和IL-6 浓度无显著差异。

2.3 单宁对绵羊血清淋巴细胞抗氧化相关基因表达的影响 由表6 可知，正试期第15 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞和的mRNA 表达量高于对照组（<0.05）。

表6 柠条中的单宁对绵羊血清淋巴细胞抗氧化相关基因表达的影响

正试期第45 天，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞和的mRNA 表达量高于对照组（<0.05）；2% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞的mRNA 表达量高于对照组和4% 单宁组（<0.05）。

正试期第75 天，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞和的mRNA表达量高于对照组（<0.05）；4% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞的mRNA 表达量高于对照组和2% 单宁组（<0.05）。

2.4 单宁对绵羊血清淋巴细胞免疫相关基因表达的影响 由表7 可知，正试期第15 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞和的mRNA表达量低于对照组（<0.05）；2% 单宁组和4% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞-的mRNA 表达量有低于对照组的趋势（=0.023）。

表7 柠条中的单宁对绵羊血清淋巴细胞免疫相关基因表达的影响

正试期第45 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞和-的mRNA 表达量低于对照组（<0.05），和的mRNA 表达量在3 组间无显著差异。

正试期第75 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊血清淋巴细胞的mRNA 表达量低于对照组（<0.05）；2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞-的mRNA 表达量有低于对照组的趋势（=0.026）；和的mRNA 表达在3 组间无显著差异。

3 讨 论

血清T-AOC、TrxR、CAT、GSH-Px、SOD 及MDA含量是反应机体抗氧化水平最直观的指标。GSHPx、T-SOD、TrxR 和CAT 是机体最主要的酶促抗氧化系统，其主要作用是清除自由基和活性氧、防止脂质过氧化物生产，分解过氧化物，阻断过氧化反应链。MDA 是脂质过氧化的最终产物，是衡量机体产生氧化损伤的重要指标。研究提出，植物多酚对机体抗氧化能力的影响机制可能与Nrf2 的表达有关。Nrf2-ARE信号通路是保护细胞免受外源性刺激和氧化损伤的主要信号通路，它能够通过调控下游一系列II 相解毒酶活性和抗氧化基因，例如、谷胱甘肽-S-转移酶（）基因mRNA 的表达，进而调控机体抗氧化功能。尚运之等以大鼠为试验模型研究没食子酸对机体抗氧化功能的影响，结果显示，没食子酸可提高小白鼠脑皮层组织中SOD、GSH-Px 活性，降低MDA含量，说明没食子酸对参与到氧化应激酶促反应的相关因子都有一定的调节作用。魏海峰在糖尿病大鼠的饲粮中添加单宁酸（20 mg/kg 及30 mg/kg），发现血清和组织中的T-SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性均有增强，而MDA 含量降低。刘华伟等建立氧化应激模型，在肉兔饲粮中添加栗树单宁，结果表明饲粮中添加栗树单宁可以显著提高肉兔血清SOD 和GSH-Px 的活性以及T-AOC，显著降低血清中MDA 含量，而且添加栗树单宁促进了肉兔肝脏组织中SOD、Cu 以及和基因表达量。陈赛娟等研究指出，在常规饲养条件下的肉兔饲粮中添加适量的单宁酸可提高血清和组织中 TrxR、CAT、GSH-Px 和SOD 等抗氧化酶的活性，同时也促进等抗氧化酶基因的表达。前人研究指出儿茶素没食子酸酯可以激活Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路，上调Nrf2 通路相关基因表达，改善组织的抗氧化能力，提高SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物（GPx）的活性，抑制NF-B 活性，降低炎症水平，从而预防大鼠梗阻性肾病。本试验得出，与对照组相比，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊血清CAT、GSH-Px、TrxR 和T-SOD 浓度，以及外周血淋巴细胞CAT、GPx1 和Nrf2 的mRNA 表达量均显著升高，而血清MDA 浓度出现不同程度的降低；4% 单宁组外周血淋巴细胞SOD1 的mRNA 表达量显著高于对照组，这与前人研究结果一致，表明饲粮中含2%和4%来源于柠条的单宁提高了绵羊的抗氧化能力。2%～4%的单宁提高绵羊抗氧化能力的原因可能是单宁激活了Nrf2/ARE 信号通路，促进Nrf2 核转位和活化，启动抗氧化应激一系列蛋白和酶的表达，增强细胞抗氧化应激的能力，这有待后续通过基因过表达和基因沉寂技术结合蛋白表达的测定来证实。

机体的免疫系统和抗氧化系统相互联系，相互影响，当机体有免疫应激反应发生时，体内的抗氧化系统也会随之失衡，从而产生氧化应激反应，而NF-B 信号通路恰好是连接这2 个系统的重要枢纽。IgA、IgG、IgM 是动物血清中主要的免疫球蛋白，其中IgG和IgM 能够帮助机体抵抗细菌和病毒的入侵，而且IgA具有IgG 和IgM 的免疫活性，可以促进机体呼吸道、消化道等局部黏膜的免疫应答。正常的机体产生炎症反应的过程取决于抗炎因子（如IL-2、IL-4、IL-10）与促炎因子（如IL-6、IL-1、TNF-）之间的平衡，使其达到既能控制各种病理性损害因素，又不至于扩大炎症反应，加重机体免疫性损害。回海勇研究表明添加单宁酸能够显著提高奶牛血清中IgG、IgM、IgA含量。陈云龙等对免疫功能低下的小鼠灌胃槲皮苷，结果表明槲皮苷能够提高小鼠的IgG、IgM 含量。邓凤君等研究了茶多酚对大鼠脊髓损伤急性期抗炎的作用，发现给大鼠灌胃25～100 mg/kg 茶多酚能降低血清IL-1、IL-6 等炎性因子含量。叶清等在田鼠饲粮中添加1.5%、3%、5% 和8% 的植物槲皮素，结果显示植物槲皮素浓度在5% 以内可降低炎性因子TNF-和IL-1含量。Matsumura 等研究表明，对小鼠灌胃2%的柿子单宁水解液，可下调IL-1、IL-6、TNF-等炎性因子的mRNA 表达量，从而抑制小鼠炎症反应。李华丽等研究表明茶多酚可以降低肉鸡IL-1、IL-6、TNF-以及NF-B 的mRNA 表达量。Qin 等研究发现，添加茶多酚（每天200 mg/kg BW）6 周能降低大鼠IL-1、IL-6 和TNF-的 mRNA 的表达，其糖尿病模型样品的抗炎因子表达得到提高。本试验得出，2%单宁组和4%单宁组绵羊血清IgG、IgA 和IgM 浓度均高于对照组，而TNF-和IL-1浓度均低于对照组，同时，2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞IL-1、TNF-和NF-B 的mRNA 表达量显著低于对照组；第15 天，2%单宁组和4%单宁组绵羊外周血淋巴细胞IL-6 的mRNA 表达量显著低于对照组，这与前人研究结果一致，表明单宁可通过抑制NF-B 通路下调炎性因子IL-1、TNF-的mRNA 表达量，提高绵羊的免疫能力。而第45 天和75 天，2% 单宁组和4% 单宁组绵羊外周血淋巴细胞IL-6 的mRNA 表达量有高于对照组的趋势，但差异不显著，这与前人研究结果不一致，其原因还有待于从蛋白表达水平等角度进行深入研究。

4 结 论

本试验结果显示，饲粮中含2%和4%单宁显著提高了绵羊血清GSH-Px、CAT、TrxR、T-SOD、IgA 和IgG 浓度，显著降低了MDA 含量和IL-1、TNF-浓度，同时显著上调绵羊外周血淋巴细胞CAT、GPx1 和Nrf2 的mRNA 表达量，显著下调IL-1、TNF-以及NF-B 的mRNA 表达量，表明饲粮中含2%～4% 的单宁可以提高绵羊的抗氧化和免疫能力。