北川羌族人群57 个常染色体InDel 位点的遗传多态性及群体遗传结构分析

蒋春月，马浩，范庆炜，杨慧凌，徐冬冬，王韵，杜冰，2

1.川北医学院基础医学与法医学院，四川 南充 637000；2.川北医学院司法鉴定中心，四川 南充 637000

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）是基因组中插入或缺失一个或多个碱基而形成的遗传标记，属于二等位基因遗传标记[1]。InDel 多态性遗传标记兼具STR和SNP的优点，突变率低，扩增片段可小于100 bp，适用于降解检材，可采用目前法医学主流遗传标记STR 常用的毛细管电泳平台进行分型，受到国内外法医学者的关注[2]。本研究拟通过调查AGCU InDel 60荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）中57 个常染色体InDel（autosomal-InDel，A-InDel）位点在四川省北川羌族自治县羌族人群中的群体遗传学数据，评估其法医学应用价值。

1 材料与方法

1.1 样本

按照知情同意原则，用FTA 采血卡采集200 例四川省北川羌族健康无关个体的血样，其中男性171例，女性29 例。

通过Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens）查询千人基因组计划Ⅲ期数据，获得5 个东亚人群、5 个南亚人群、7 个非洲人群、4 个美洲人群以及5 个欧洲人群共26 个人群的InDel 位点基因型和等位基因频率作为比较数据，探讨本研究人群与这些人群的遗传关系，具体信息见表1。

表1 数据库中26 个人群的信息Tab.1 Information of 26 populations in the database

本研究已获得川北医学院伦理委员会批准，审批文号为［2021］14 号。

1.2 PCR 扩增

根据AGCU InDel 60 荧光检测试剂盒说明书，采用直接扩增法（免提取）对血样进行PCR 扩增。扩增体系为10 μL，其中Reaction Mix 4 μL、InDel 60 Primers 2 μL、热启动U-Taq酶0.4 μL、去离子水3.6 μL，模板DNA为直径1.2 mm的血斑1片。采用9700型PCR仪（美国Applied Biosystems 公司）进行扩增，扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，62 ℃60 s，25 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。

1.3 毛细管电泳和数据分析

采用3500 基因分析仪（美国Applied Biosystems公司）进行毛细管电泳。取1 μL PCR 产物、10 μL去离子甲酰胺和0.3 μL 内标AGCU Marker SIZ-500 混匀，95 ℃变性3 min 后，立即冰浴3 min。用GeneMapper®ID-X1.4 软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行分型。InDel 位点中的插入（insertion）等位基因和缺失（deletion）等位基因分别命名为I 和D，Amelogenin位点的两个等位基因分别为X 和Y。

1.4 质量控制

每批样本的检测均采用去离子水和标准品9948分别作为扩增的阴性对照和阳性对照。

1.5 统计分析

采用Modified-Powerstats 标准版软件计算获得57 个A-InDel 位点的等位基因频率（Fins和Fdel）、DP、PIC、CDP。采用Cervus 3.0.7 软件（http://www.fieldge netics.com/pages/home.jsp）进行Hardy-Weinberg 平衡检验，并计算Ho、He、PEtrio、PEduo、CPEtrio和CPEduo。使用STRAF 网页版（http://cmpg.unibe.ch/shiny/STRAF/）进行连锁不平衡分析。采用Arlequin 3.5.2.2软件计算遗传分化系数（Fst），并基于基因型数据计算27 个人群的Fst遗传距离，再用MEGA 5.05 软件（https://megasoft ware.net/）采用邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。采用POPTREE2 软件基于基因频率计算27 个人群的Nei’s 遗传距离，并采用NJ 法构建系统发育树。

2 结果

2.1 等位基因分型结果

200 例北川羌族无关个体的血样中，57 个AInDel、2 个Y-InDel 和Amelogenin位点均得到有效扩增，扩增产物片段均在80～230 bp，InDel 位点信息见表2。男性样本的Y-InDel 位点检测到1 个等位基因，Amelogenin位点检测结果为XY；女性样本的Y-InDel位点检测结果为阴性，Amelogenin位点检测结果为X。

表2 北川羌族人群59 个A-InDel位点的基本信息Tab.2 Basic information of 59 A-InDels in Beichuan Qiang population

2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验

经Hardy-Weinberg 平衡检验，57 个A-InDel 位点中，除rs5787309、rs10590825、rs1160980、rs33971783和rs561160795 外，其余52 个位点均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。采用Bonferroni法进行校正，57 个A-InDel 位点的P值均大于0.000 88（0.05/57），表明所有位点均符合Hardy-Weinberg 平衡。

2.3 连锁不平衡检验

57个A-InDel位点两两之间共进行了1 596次连锁不平衡检验，其中87 次比较结果的P值为0.000 947～0.049 932，且该87 对两两比较的位点均位于不同的染色体上。经过Bonferroni法校正，各位点间均不存在连锁不平衡现象［P值均大于0.000 031（0.05/1 596）］。

2.4 等位基因频率及群体遗传学参数

57个A-InDel位点的等位基因频率及群体遗传学参数见表3。Fdel值为0.272 5～0.760 0，Fins值为0.240 0～0.727 5；Ho值为0.370 0～0.585 0，He 值为0.365 7～0.501 2，PIC 值为0.298 3～0.375 0，DP 值为0.529 5～0.659 0，PEtrio值为0.234 9～0.281 2，PEduo值为0.066 5～0.125 0。由于57个A-InDel位点间处于连锁平衡状态，故可采用乘积定律计算其CDP 和CPE。57 个A-InDel位点在北川羌族人群中的CDP 值为1-2.974 8×10-24，CPEtrio值为0.999 999 999，CPEduo值为0.999 062 660。

2.5 北川羌族人群与其他人群基于57个A-InDel位点的群体遗传学比较

应用本研究获得的北川羌族人群和数据库所得26 个人群57 个A-InDel 位点的数据，计算得到Fst值（表3）、Fst遗传距离（图1）和Nei’s 遗传距离（表4）。rs151335218、rs769299 和rs140683187 等22 个InDel位点的Fst值小于0.06，其余35 个InDel 位点的Fst值均大于0.06。Nei’s 遗传距离和Fst遗传距离均显示北川羌族人群与北京汉族和南方汉族人群遗传距离最近，与冈比亚西部人群遗传距离最远。

图1 27 个人群的Fst遗传距离Fig.1 Fst genetic distances of 27 populations

表3 北川羌族人群57 个A-InDel位点的等位基因频率及群体遗传学参数Tab.3 Allele frequencies and population genetic parameters of 57 A-InDels in Beichuan Qiang population（n=200）

续表3Continued Tab.3

根据Nei’s 遗传距离和Fst遗传距离，采用NJ 法构建27 个人群间的系统发育树。基于Nei’s 遗传距离的系统发育树（图2A）显示，整个系统发育树主要分为4个分支，北川羌族人群与东亚人群位于同一分支。基于Fst遗传距离的系统发育树（图2B）群体分布格局与基于Nei’s 遗传距离的系统发育树相似。

图2 27 个人群间的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees of 27 populations

3 讨论

羌族是我国少数民族之一，根据第六次全国人口普查结果，羌族的总人口数为309 576 人[3]，主要居住在四川省阿坝藏族羌族自治州的茂县、汶川、理县和北川羌族自治县[4]。羌族的民族语言是羌语，属于汉藏语系中藏缅语族的羌族分支。目前已有学者[5-7]对羌族线粒体DNA、SNP 和STR 等遗传标记的多态性进行了研究，本研究对200 例羌族健康无关个体57 个A-InDel 位点的遗传多态性进行调查分析，为InDel 遗传标记的法医学应用提供了基础数据。

本研究结果显示，经Bonferroni 法校正后，57 个A-InDel 位点均符合Hardy-Weinberg 平衡，因此，本研究样本资料可靠。连锁不平衡检验结果显示，57 个A-InDel 位点在北川羌族人群中不存在连锁不平衡现象（P＞0.000 031），提示这些位点是相互独立的遗传标记，可用于法医学鉴定。北川羌族人群57 个AInDel位点中，除rs66595817、rs72085595外，其余55个位点的等位基因频率均在0.3～0.7范围内，表明这57个A-InDel 位点在北川羌族人群中的等位基因分布较均衡。由表3 可见，Fins、DP、PIC、Ho、He、PEduo、PEtrio的最小值均在rs72085595 出现，该位点在已报道的藏族[8]、成都汉族[8]、摩梭人[8]、黑龙江汉族[9]、上海汉族[9]等人群中的Fins、H 及PIC 也较低，提示该位点在亚洲人群中的遗传多态性可能较低。57 个A-InDel 位点在北川羌族人群中的CDP 值为1-2.974 8×10-24，高于0.999 999 999 999 99，可以应用于法医学个体识别；而CPEtrio值 为0.999 999 999，CPEduo值 为0.999 062 660（小于0.999 9），提示其可以应用于三联体亲子鉴定，单独应用不能满足二联体亲子鉴定要求，但可作为常规STR 检测试剂盒的补充和验证。

Fst反映了特定基因座在群体间分布的差异程度，Fst值越小，说明差异程度越小[10]。有学者[11]认为，Fst值小于0.06 可保证所选择的位点适用于不同群体，从而得到稳定的个体识别能力。本研究中rs151335218、rs769299、rs140683187 等22 个A-InDel位点的Fst值小于0.06，提示该22 个A-InDel 位点在27 个人群间差异很小，可适用于不同群体。另外，rs34421865、rs3076465、rs34287950 等35 个A-InDel位点的Fst值大于0.06，说明这35 个位点在27 个人群间基因频率差异较大，在群体遗传学和种群识别方面有重要的应用价值[10]。

遗传距离是用于评估群体间遗传差异或遗传分化的重要参数。本研究中北川羌族人群与北京汉族和南方汉族人群遗传距离最近，与非洲人群遗传距离较远，其中与冈比亚西部人群遗传距离最远，提示遗传距离和实际地域的物理距离区分度基本相似。此外，基于Nei’s 遗传距离构建的系统发育树（图2A）显示有4 个主要分支（东亚分支、南亚分支、欧洲分支和非洲分支），提示群体所处地理位置与遗传距离密切相关；美洲人群分散在东亚和非洲的分支，可能是因为二战前亚洲及非洲人口迁移至美洲所致[12]。就研究人群而言，北川羌族人群属于东亚分支，与南方汉族和日本人群首先聚类，该结果与王敬方等[6]对四川羌族SNP 多态性进行分析得到的结论类似。为了进一步验证27 个人群之间的遗传结构，本研究使用基因型数据计算Fst遗传距离并构建了系统发育树（图2B）。基于Fst遗传距离构建的系统发育树群体分布格局与基于Nei’s 遗传距离构建的系统发育树相似，但北川羌族与北京汉族人群的遗传关系更为密切。由此可以看出，基于基因频率的Nei’s 遗传距离的分析结果与基于基因型的Fst遗传距离的分析结果基本一致，提示这57 个A-InDel 位点在一定程度上可以用于生物地理祖先推断。

本研究获得了57 个A-InDel 位点在四川省北川羌族人群中的等位基因频率及遗传学参数，为法医学应用研究提供了基础数据。