兔ESR1基因在不同品种和组织中的差异表达

张翠霞，张翔宇，杨 超，唐 丽，雷 岷，季 杨，李 超，任永军，邝良德，郭志强，郑 洁，李丛艳，谢晓红

(1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066;3.中化现代农业四川有限公司，成都 610066)

【研究意义】雌激素受体基因(Estrogen receptor，ESR)是影响畜禽繁殖性状的重要功能候选基因，通过与靶基因上特异性效应元件的结合，改变畜禽雌激素基因的转录，进而对雌性第二特征、繁殖周期、生殖力、妊娠维持产生影响[1]。本研究旨在探究ESR基因在家兔群体不同性腺组织中的表达规律及其在分子调控机制中发挥的作用，为利用分子标记技术改良家兔繁殖性状提供科学依据。【前人研究进展】雌激素受体基因在动物性腺组织中广泛表达并在繁殖调控机制中发挥着极其重要的作用[2-4]。ESR基因作为影响畜禽繁殖性状的重要功能候选基因被广泛研究，其通过与靶基因上特异性效应元件结合，改变雌激素基因转录，进而对雌性第二特征、繁殖周期、生殖力、胚胎发育、妊娠维持等繁殖性能产生影响[5]。ESR基因表达受其特异性启动子控制[6]，根据细胞的特异性不同从某个启动子开始，人的ESR基因转录从其cDNA中的+99、+234 和+258 3个不同起始密码子开始，获得3种编码区完全一致的mRNA。人、鸡、鼠等多个物种的ESR基因已被成功克隆。人的ESR基因全长140 kb，完整编码区长1788 bp，编码595个氨基酸残基。ESR基因具有较强的保守性，人与鸡的同源性高达 88%，人与鼠的同源性达到 80%，鼠与鸡的同源性是 77%[7-9]。通过分子生物学方法对不同组织中ESR的mRNA进行定位分析发现，ESR1主要分布在雌性动物性腺组织、肝组织、骨骼组织和中枢神经组织等[10]。【本研究切入点】目前的研究均未阐明ESR1 如何影响家兔繁殖性能，在其不同生理周期和组织的表达规律也未见报道。【拟解决的关键问题】研究家兔不同群体组织中ESR1基因的时空表达差异，为阐明影响家兔繁殖性状的重要调控因子提供基础数据，以期利用ESR基因作为繁殖性状候选遗传标记，应用于家兔分子育种，为家兔专门化品系和配套系的选育提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以齐卡巨型白兔、加利福尼亚兔和齐兴肉兔3个家兔品种为试验材料，每个品种各选60只繁殖母兔组成试验群体，在相同饲养管理条件下饲喂。每个品种分别选取3只空怀母兔和已怀孕14 d的妊娠母兔进行屠宰，取其卵巢、输卵管和子宫等组织，用DEPC水清洗并立即放于液氮罐中速冻，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和检测 采用Trizol法(Trizol Reagent, Invitrogen)提取供试家兔卵巢、子宫及输卵管组织的总RNA。Nano Drop 2000 分光光度计检测RNA 浓度和纯度，用1% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，-80 ℃低温冰箱保存。

1.2.2 引物设计 从NCBI数据库中搜索基因全序列，使用Primer Premier软件设计筛选各基因特异性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以ULTRAPAGE纯化(表1)。

表1 本次检测所用引物及碱基序列

1.2.3 cDNA合成 利用试剂盒反转录合成cDNA:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer2 4.0 μL， 总 RNA 10.0 μL，RNase Free dH2O 4 μL,依次加入各试剂，进行PCR反应，将反转录产物进行稀释，用 GAPDH 进行 PCR 结果检测，将检测合格的 cDNA 置于 -20 ℃冰箱保存，用于检测ESR基因的表达情况。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应 反应体系：PCR2×Real PCR Easy TM Mix-SYBR 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.8 μL，Template(DNA)2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。反应程序：95 ℃ 预变性 30 s；95 ℃ 变性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，45 个循环，每个样品3次重复。以GAPDH基因为内参基因进行校正，采集荧光。

1.2.5 统计分析 使用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo公司)分析PCR过程中各检测样本的CT(Threshold cycle)值。通过2-△△CT计算ESR基因相对mRNA表达水平。采用一般线性模型，对数据进行单因素ANOVA 分析，使用 LSD 法进行多重比较，数据结果以平均值 ± 标准误表示，所有计算由用 SPSS 16.0完成。

2 结果与分析

2.1 兔ESR1基因的RT-PCR检测结果

将肉兔卵巢、子宫和输卵管组织中ESR基因进行扩增，最终得到扩增曲线和溶解曲线(图 1)，ESR基因和参考基因 GAPDH扩增曲线皆呈“S”形态，平滑基线，动力学曲线整体平行性趋势较好，符合后续试验要求。CT 值适当，表明定量结果准确可靠。ESR和GAPDH基因的溶解曲线呈单峰状，特异性扩增产物可呈现荧光，无杂质二聚体峰等出现，结果准确且具有代表性，数据可应用于进一步表达差异分析。

图1 GAPDH的扩增曲线和溶解曲线Fig.1 Amplification curve and melting curve of GAPDH gene

图2 ESR1的扩增曲线和溶解曲线Fig.2 Amplification curve and melting curve of ESR1 gene

2.2 ESR1基因在各品种肉兔及各组织间的表达情况

为研究ESR1基因在不同品种家兔组织中的表达差异，通过RT-PCR方法对ESR基因在齐卡巨型白兔、加尼福尼亚兔和齐兴肉兔的卵巢、输卵管和子宫等组织中的表达量进行检测，采用GAPDH基因对表达水平进行均一化处理，采用 2-△△CT法对不同组织的表达量进行计算，获得ESR基因在多个组织中 mRNA 表达情况。从图3可知，就同一组织不同品种分析发现，ESR基因在卵巢中表达量依次为齐兴白兔>齐卡巨型白兔>加利福尼亚兔；ESR基因在子宫中的表达量依次为齐卡巨型白兔>齐兴白兔>加利福尼亚兔；ESR基因在输卵管中的表达量趋势同卵巢一致。就同一家兔品种不同组织分析发现，齐兴白兔群体中ESR基因的表达量依次为卵巢>子宫>输卵管；ESR基因在加利福尼亚兔群体中的表达量依次为输卵管>卵巢>子宫；ESR基因在齐卡巨型白兔群体中的表达量依次为子宫>卵巢>输卵管。说明，ESR1基因在3个品种家兔的卵巢、输卵管和子宫等组织中具有不同程度的表达。

图3 妊娠期ESR基因在不同家兔品种和不同组织中的表达量Fig.3 Tissue expression of ESR gene in different breeds during pregnancy

2.3 ESR1基因在齐卡巨型白兔不同繁殖时期不同组织的表达情况

为研究ESR1基因与繁殖性状的相关性，通过RT-PCR方法对ESR基因在空怀和妊娠14 d的齐卡巨型白兔母兔不同性腺组织中的表达进行检测，采用GAPDH基因对表达水平进行均一化处理，采用 2-△△CT法对不同组织的表达量进行计算，获得ESR基因在多个组织中 mRNA 表达情况(图4)。在不同繁殖时期，齐卡巨型白兔的卵巢、输卵管和子宫等组织中均有ESR基因表达，且表达趋势趋于一致，表达量依次为子宫>输卵管>卵巢。进一步对卵巢、输卵管和子宫等组织的ESR基因表达量分析发现，ESR1基因在空怀母兔子宫的表达量显著高于妊娠母兔(P<0.05),空怀母兔输卵管的表达量显著高于妊娠母兔(P<0.05)。

图4 齐卡巨型白兔ESR基因在不同繁殖时期组织的表达量Fig.4 The expression of ESR gene in different reproductive stages of ZIKA rabbits

3 讨 论

3.1 ESR1基因在不同家兔品种和性腺组织间的表达

雌激素广泛存在于动物体内，其主要通过与雌激素受体结合发挥重要的生物学功能。大量研究显示，雌激素受体在动物的不同组织中均有不同程度的表达。田志龙等[11]研究发现，ESR在具有不同繁殖力的小尾寒羊群体的小脑、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等12个组织中均有表达。ESR1和ESR2基因在人正常乳腺组织及纤维腺瘤中均有表达，ESR1基因还在导管上皮细胞及细胞核内表达[12]。李江森[13]对不同日龄香猪睾丸发育进行研究，ESR1基因的表达量随日龄增长而发生变化，首次发现香猪睾丸生精小管细胞胞质中存在ESR2基因的表达，输出小管的表达量显著低于附睾管的表达量(P<0.05)。彭婷婷等[14]利用RT-PCR检测证实小鼠眼视网膜组织中ESR的存在，且不同性别及月龄存在差异表达。ESR基因与小尾寒羊、湖羊繁殖性状具有相关性[15-16]，ESR1基因主要在小尾寒羊输卵管、子宫、卵巢表达[17-19]，本研究在怀孕期齐卡巨型白兔、加尼福尼亚兔和齐兴肉兔的卵巢、输卵管和子宫等组织中均检测到ESR1基因的表达，表明ESR1基因在家兔繁殖过程中可能起着重要作用，但具体机制有待继续研究。

3.2 ESR1 基因表达对家兔繁殖的影响

ESR1基因对人类及动物生殖系统的发育具有重要作用，影响卵泡发育、受精和胚胎着床等重要生理过程[20-21]。Hong等[22]研究发现，人类未分化的胚胎干细胞发现，ESR1与ESR2基因表达量均有明显差异，ESR1在人类胚胎期生长的第2、4、6天中未见明显变化趋势，ESR2在第2天上调后迅速下降，说明ESR1和ESR2在胚胎干细胞分化过程中的作用不同。采用免疫组化染色方法发现，ESR1基因在母猪早期妊娠期不同时期的卵巢中均有表达且表达存在差异，母猪胚胎第61天时，表达量比较多的是卵巢表面上皮、卵母细胞，皮质部分的原始卵泡等[23]。Vaskivuo等[24]报道，在20周的胎儿卵巢卵子的胞浆检测到ESR1和ESR2基因的表达。研究发现，雌激素和ESR1结合后可以调节产道相关基因的表达和生理作用[25]。Baranda-Avila等[26]利用RT-PCR技术对妊娠早期家兔输卵管不同时期壶腹和峡部ESR1基因的表达进行了分析，ESR1基因在早孕母兔的产道存在差异表达，妊娠母兔ESR1基因的表达量高于非妊娠母兔，妊娠母兔壶腹的ESR1基因表达量在怀孕第3天达到最高，第4天开始下降。而妊娠母兔峡部ESR1基因的表达量在前3 d持续增加，第3天达到最大值。本研究对同一品种家兔不同组织ESR基因的表达量进行分析发现，齐兴肉兔群体ESR基因的表达量依次为卵巢>子宫 >输卵管；加利福尼亚兔ESR基因的表达量依次为输卵管>卵巢>子宫；齐卡巨型兔群体ESR基因的表达量依次为子宫>卵巢>输卵管，ESR基因的表达量不同暗示ESR1在不同品种家兔怀孕过程中所起的作用可能存在差异。本研究显示，ESR1基因在空怀和妊娠14 d的齐卡巨型白兔母兔的子宫、卵巢、输卵管组织中均有表达，且表达趋势基本一致，从高到低依次为子宫、输卵管、卵巢，进一步分析发现，ESR1基因在空怀母兔子宫中的表达量显著高于妊娠母兔(P<0.05),空怀母兔输卵管中ESR1基因的表达量显著高于妊娠母兔(P<0.05)，这可能和ESR1基因参与家兔早期妊娠调控有关，而妊娠后期随着胎儿的发育，母兔不同性腺组织ESR1基因表达量有所下降，其调控机制有待进一步研究。

4 结 论

在怀孕期齐卡巨型白兔、加尼福尼亚兔和齐兴肉兔的卵巢、输卵管和子宫等组织中均检测到ESR1基因的表达，表明ESR1基因在家兔繁殖过程中可能起着重要作用。ESR1基因在齐卡巨型母兔的性腺组织中不同生理阶段的表达量存在差异，可能与该品种的繁殖力有关，本研究可为阐明影响家兔繁殖性状的重要调控因子提供基础数据。