低温胁迫下野生马齿苋转录组分析

叶梅荣，王晓鹏，黄守程

(安徽科技学院生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

【研究意义】马齿苋(PortulacaoleraceaL.)属于马齿苋科(Portulacaceae)马齿苋属(Portulaca)类野生药食同源植物，除寒冷带地区外，世界各地均有分布，具有食用和药用的功效，是世界最普通的野生植物之一[1]。马齿苋营养价值高[2-3]，且具有抗菌、抗炎的功能，对胃癌、肝癌、糖尿病等具有一定的疗效[4-5]；其对外界的高温、干旱、高湿、高盐、重金属污染等不良环境的适应能力强大[6-7]，但不耐低温，低温是限制马齿苋生长发育和地理分布的主要环境因素，因此鉴于其不耐低温，拟通过二代和三代转录组测序技术研究马齿苋在低温胁迫下转录表达差异，以期为马齿苋低温胁迫研究及培育马齿苋耐低温品种研究等提供参考依据。低温胁迫一般出现在早春、晚秋和冬季，低温胁迫是限制植物生长发育和地理分布最主要的自然因子之一[8]。低温胁迫下，植物生理代谢功能受阻，如光合作用下降，呼吸作用先升后降，生物分解大于生物合成而造成物质代谢失调，植物吸水小于失水而造成的水分代谢失衡，膜系统受到破坏，透性增加导致细胞内容物外渗，从而造成植物永久性伤害，甚至死亡。因此，探讨植物在低温胁迫下的生理及分子机制对农业生产非常重要，有助于耐寒植物品种的培育，从而增加植物的种植面积，有利提高作物产量和经济效益。【前人研究进展】随着分子生物学技术的发展，已从转录组、蛋白组、代谢组及转录翻译调控等不同层面研究植物低温胁迫的分子机制[8]。如二代和三代的高通量测序技术，使得基因组的研究得到了空前发展；而二代、三代的转录组测序技术为所有物种的转录组研究提供了可能[9]。如张少平等[10]利用转录组和代谢组分析马齿苋根茎叶中类黄酮代谢，张鹤等[11]分析了低温胁迫下花生(ArachishypogaeaL.)幼苗的转录组；齐晓等[12]鉴定了紫花苜蓿(Medicagosativa)响应低温胁迫的转录因子，并且发现在低温胁迫诱导下不同转录因子家族基因表达存在差异；白雪等[13]分析了低温条件下蓖麻(RicinuscommunisL.)种子萌发期转录组。田玉珍等[14]分析了苹果(Malusdomestica)树体休眠期前花芽对低温早期响应的转录组，揭示了Ca2+信号转导可能主要参与了苹果花芽的冷响应过程。目前三代Isoform sequencing(Iso-Seq)技术在无需参考基因组情况下，可获得全长转录组，极有利深入揭示生物体的转录机制[15-16]。如Kuang等[17]用Iso-Seq技术分析东北红豆杉(Taxuscuspidata)的转录基因组揭示了紫杉醇生物合成的复杂性；Minio等[18]基于Iso-Seq技术分析葡萄(CabernetSauvignon)浆果发育的转录组。【本研究切入点】目前对马齿苋的研究主要集中在栽培、抗性(如抗旱性、抗盐性和抗涝性等)、食用和药用价值等方面，对其不耐低温胁迫机制的研究未见报道，因此本研究从其转录组方面探讨低温胁迫对马齿苋生长发育的影响机制。【拟解决的关键问题】采用二代和三代转录组测序技术分析马齿苋在低温胁迫下转录表达差异，筛选差异表达基因，阐释低温胁迫对马齿苋生长发育的影响机制，以期为马齿苋耐低温品种筛选和培育提供参考依据，也为马齿苋的栽培种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

马齿苋种子种在花盆里(盆高14 cm，下口直径11 cm，上口直径23 cm)，通用型中禾营养土作为种植基质。马齿苋培养在光照培养箱里，白天温度设置为30 ℃、14 h，晚上为25 ℃、10 h。种子萌发后，每盆只保留5株苗，待苗高度长至5 cm 左右，进行低温处理(缩写为LTS，白天10 ℃、14 h，晚上5 ℃、10 h)，适温处理(缩写为C，白天30 ℃、14 h，晚上25 ℃、10 h)，处理14 d后，取马齿苋的成熟叶片装在封口塑料袋子里立即投入液氮里速冻，然后埋在干冰里速运到武汉贝纳科技服务有限公司进行三代和二代转录组测序和分析。

1.2 总RNA提取、cDNA文库构建和转录组测序

首先提取马齿苋样本高质量的RNA，RNA的大小和降解程度用琼脂糖凝胶电泳检测，RNA的纯度和浓度用NanoDrop ND-1000 超微量分光光度计检测，RNA的完整性采用Agilent2100 生物分析仪精确检测，高通量测序用Illumina HiSeq 2500 测序平台进行。

1.3 数据处理

原始测序数据(Raw data)经过过滤得到clean reads，基于目前马齿苋没有参考转录基因组，因此用三代测序得到的全长非嵌合的转录本经CD-HIT去冗余后获得的isoform 作为参考系列进行比对，比对结果用RSEM进行统计，以FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)≥1 为标准筛选有效表达基因，以qvalue<0.05，|log2FoldChange|>1为标准，利用DEGseq 软件筛选差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)。所有数据已上传NCBI(BioProject：PRJNA734447)。

1.4 差异表达基因GO分析和KEGG分析

GO富集分析根据Gene Ontology 进行，Pathway 富集分析根据KEGG 公共数据库进行。

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据分析

从表1可知，9个样本获得的clean reads在39 097 730～56 767 358，样本产生的clean bases在5864 659 500～8515 103 700 bp，最少产生5.86 Gb的高质量数据，GC比在46.82%～48.21%，Q20 碱基百分比在97.58%～97.85%，Q30碱基百分比在93.04%～93.75%。以上数据显示样本的测序质量和文库构建质量都比较好，能用于后续分析。

表1 低温胁迫下马齿苋叶片转录组数据统计

2.2 与全长转录本序列比对

以全长非嵌合的转录本经过CD-HIT去冗余后得到的isoform作为参考序列，用Bowtie2软件将二代高通量测序数据与上述参考序列进行比对，结果见表2，只有唯一比对位点的reads、有多个比对位点的reads和未比对上的reads占总reads的比值分别为6.71%～9.15%、73.98%～80.24%和12.45%～16.88%。有多个比对位点的reads占比较高，因此二代测序数据质量较好。

表2 二代数据比对到三代参考序列的结果

表3 重复处理间的相关性系数分析

2.3 基因表达量及差异表达基因分析

除对照C3在1C，其次是110的基因数量最少，并且在这区域转录本数目C>LTS(图1)。转录本表达的箱线图(图2)，不仅显示各个样品转录本表达水平的离散程度，而且比较不同样品的整体转录本表达水平，不同处理的转录本整体离散程度基本一致。

图1 对照和冷胁迫处理下马齿苋的基因表达量分布 Fig.1 Distribution of gene expression of P.oleracea under control and low temperature stress treatment

图2 对照和冷胁迫处理下马齿苋的FPKM箱线图Fig.2 The diagram of FPKM of P.oleracea under control and low temperature stress treatment

2.4 样品相关性

重复处理间样品相关程度的分析可以揭示重复处理间样品的相关度，从表3可看出,重复处理间的皮尔逊(Person)相关系数都大于0.8，揭示每种处理间3次重复的相关性较强，而不同处理间的相关度都小于0.8，暗示相关性不强。

2.5 差异表达转录本的筛选

差异表达基因(DEGs)用软件DESeq2筛选，上调差异表达基因筛选标准是qvalue<0.05，且log2FoldChange>1，而下调差异表达基因则是qvalue<0.05，且log2FoldChange<-1。不同处理前后的差异基因分布可以用差异基因火山图来表示(图3)，其中用红色代表显著上调的基因，以绿色代表显著下调的基因，以黑色代表无显著性差异的基因。结果表明C vs LTS之间有26 621个差异表达基因，其中包括上调12 045个DEGs，下调14 576个DEGs。

图3 对照相对低温胁迫处理的马齿苋火山图 Fig.3 Volcano map of P.oleracea under control compared to low temperature stress treatment

2.6 马齿苋响应低温胁迫差异表达基因的GO和KEGG分析

根据qvalue值大小列出前20个差异表达基因显著富集的GO条目(表4)。马齿苋对紫外光A、高光强、远红光、红光、蓝光、紫外光B、叶绿素生物合成过程和光保护等基因的调节，其上调的基因数目显著大于下调的基因数目；而对丙酮酸磷酸双激酶活性、金属离子转运、调节碳水化合物代谢过程和光系统反应中心I等方面的基因，其下调基因数目明显大于上调基因数目。C vs LTS差异表达基因的KEGG富集表现在蛋白酶体、DNA复制、真核生物的核糖体起源、昼夜节律、玉米素生物合成、氰基氨基酸代谢、萜类主链生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成等方面。

表4 DEGs的GO富集分析

图4 对照和冷胁迫相比差异表达基因KEGG富集Fig.4 KEGG enrichment of DEGs in control compared to low temperature stress treatment

3 讨 论

低温胁迫严重影响了植物生长、发育和分布，因此研究低温胁迫下植物的适应性机制对提高农业生产具有重要的意义。现在高通量转录组测序技术为低温胁迫分子机制的研究提供了途径和方法。如对低温胁迫下百香果(PassifloraeduliaSims)[19]、高加索三叶草(TrifoliumambiguumBieb.)[20]、早熟禾(Poapratensis)[21]、苦瓜(MomordicacharantiaL．)[22]、仁用杏花(PrunusarmeniacaL.)[23]和黄花蒿(Artemisiaannua)[24]等转录基因组的研究，揭示了低温胁迫下显著存在差异基因表达，一些代谢途径如淀粉和蔗糖合成途径、激素转导途径等参与低温胁迫响应，且揭示了一些响应低温胁迫的转录因子如AP2/ERF、ZFP、MYB等。这些说明植物在低温胁迫下能诱导一些基因表达，产生生理代谢变化，从而提高植物的抗冷和抗寒性。本研究发现C vs LTS相比马齿苋对不同光反应、叶绿素生物合成、光保护、苏氨酸类肽链内切酶活性、几丁质反应等上调表达的基因数目明显高于下调表达的基因数目；而对丙酮酸磷酸二激酶活性、金属离子转运、细胞质大核糖体亚基、调节碳水化合物代谢过程、光系统反应中心Ⅰ等上调表达的基因数目明显低于下调表达基因数目。马齿苋为C4植物，低温胁迫下，GO分析显示其明显下调了对不同光的反应和叶绿素的生物合成的基因数目，但是反而明显上调了丙酮酸磷酸二激酶活性、调节碳水化合物代谢过程和光系统反应中心Ⅰ等基因数目，这似乎很矛盾，可能也正好说明马齿苋抗逆性强的原因，因为丙酮酸磷酸二激酶是促进C4植物的光合碳循环CO2底物磷酸烯醇式丙酮酸再生的酶，该酶基因被上调，说明底物再生可能被增加，即光合作用明显升高，能有效合成光合产物供其生长；但因对各种光反应、叶绿素合成等基因数目明显被下调，可能造成光吸收的减少和叶绿素合成的下降，可能长时间低温胁迫会导致马齿苋光合能力下降，即低温胁迫明显影响马齿苋的光合作用。而低温胁迫下，马齿苋的茎杆变成紫红色，这可能因为马齿苋通过积累可溶性糖进行渗透调节来抵御低温胁迫，从而增加了花色素苷的合成，这样可能有利提高对低温胁迫的耐性，这些有待进一步将转录组和代谢组结合起来进行分析。蛋白质是生命功能的体现者，而植物遭受干旱、低温等非生物逆境胁迫时会导致植物受到伤害和各种异常蛋白质的积累，细胞的结构和功能遭到破坏，细胞的各种代谢功能和生长发育受到影响。付晨熙等[25]研究认为相关蛋白质表达水平发生变化是植物对逆境的防御机制。而蛋白酶体，尤其植物体内的泛素/26S蛋白酶体降解途径，能介导植物中80%～85%的蛋白质降解，能有效清除异常蛋白质，对维护细胞的稳定性具有重要的作用，因此其成为植物调控非生物胁迫的一种重要途径[26]。乌凤章和王贺新[27]认为蛋白质泛素化介导了植物低温胁迫反应，并认为在低温胁迫下导致不同物种产生了重大的转录组重新编程，参与植物低温胁迫反应调节的是泛素连接酶(Ubiquitin-ligase enzymes，E3)；王爽和李海英[28]认为E3泛素连接酶可以响应不同的胁迫反应(如干旱、盐胁迫、冷胁迫)，但调控方式并不相同。本研究发现C vs LTS相比KEGG显著富集蛋白酶体差异表达基因，富集的蛋白酶体差异表达基因是否和蛋白质降解有关？另外也发现显著富集萜类及带苯环的氨基酸的生物合成，暗示适温情况下马齿苋的次生代谢明显，这些有待进一步研究。本研究探讨了低温胁迫下马齿苋差异表达基因的差异，为培育耐冷性马齿苋品种提供参考，也为低温胁迫下马齿苋抗逆性的分子机制研究提供参考依据。

4 结 论

采用二代和三代转录组测序对低温胁迫下野生马齿苋转录组分析，发现低温胁迫和适温相比共有26 621个差异表达基因(DEGs)，其中上调的DEGs为12 045个，下调的DEGs为14 576个。适温和低温胁迫相比导致马齿苋虽明显上调了对各种光反应的基因数目，但显著下调了丙酮酸磷酸二激酶的活性的基因数目，暗示低温胁迫可能明显影响了马齿苋的光合作用。