外泌体长链非编码RNA在肝癌中的研究进展

葛子强，张显赫，黄子越，夏浩明，徐艺，王志东

哈尔滨医科大学附属第二医院胆胰外科，黑龙江 哈尔滨 150086

作为世界上第六大常见的癌症及全球癌症死亡率的第二大原因[1]，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)占原发性肝癌(primary liver cancer， PLC)的85%～90%[2]。HCC的危险因素包括肝硬化、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的慢性感染、非酒精性脂肪肝、过度饮酒、遗传因素、肥胖及吸烟等[3]。目前HCC的诊断方法仍然存在许多局限，血清甲胎蛋白(AFP)被广泛用于HCC的早期筛查，但在肝炎、肝硬化等非恶性肿瘤的肝脏疾病中也会出现不同程度的升高[4]；且肝脏CT及磁共振成像(MRI)对<2 cm的结节显示不清[5]。由于缺乏特异性高的生物标志物和不良临床症状，大多数HCC病人发现时已出现肝内或肝外转移，根治性手术治疗仍为HCC的有效治疗手段，但术后高复发率导致HCC病人总体5年生存率仅为50%～70%，而晚期HCC病人5年生存率则不到15%[5]。

外泌体(exosome)是由机体内活细胞分泌的广泛存在于各种体液中大小约40～160 nm、具有脂质双层膜的细胞外囊泡，通过跨膜蛋白与靶细胞受体直接作用、质膜融合或直接接触将内含DNA、RNA、脂质、蛋白质及小分子代谢物等生物信息分子传递至靶细胞内，建立细胞间信息传递系统，介导并参与抗原呈递、细胞分化、生长、肿瘤中的免疫反应、肿瘤细胞的迁移和侵袭等过程从而调节受体细胞的生物学行为[6-7]。外泌体最初被认为是清除细胞中降解的和不需要的细胞成分的垃圾箱。基于其独特分子结构及其低免疫原性与细胞毒性，外泌体携带的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)可免受核糖核酸酶诱导的降解呈稳定表达，表明它们可能是细胞间交流的载体[8]；其次外泌体ncRNA的组织特异性与空间特异性提示其可以体现不同肿瘤的特征或在肿瘤发生发展中发挥作用[9]。长链非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)是一类无蛋白编码能力的、长度超过200个核苷酸的RNA分子，研究显示外泌体lncRNA参与介导包括HCC、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤的生物学行为。此文将对外泌体lncRNA调节HCC发生发展及其在HCC诊治、预后中的作用加以综述。

一、外泌体lncRNA参与HCC恶性生物学行为

1.外泌体lncRNA参与增殖与抗凋亡 肿瘤细胞通过获得持续增殖信号达成细胞无限增殖及逃逸程序性的细胞凋亡，最终实现癌细胞的长久存活，但其分子发生机制不尽相同。Kogure等[10]研究证实HCC肿瘤细胞(Hep3B、PLC/PRF/5)衍生的外泌体可被相邻细胞吸收，且相比于供体细胞，共有14个超级保守的lncRNA在外泌体中表达发生显著变化，其中TUC339在外泌体中高度富集。利用小干扰RNA外源性沉默lncRNA TUC339可抑制肿瘤细胞的增殖以及对细胞外基质的黏附能力，提示外泌体介导的lncRNA TUC339可充当细胞间信号传导介质，调节肿瘤细胞局部微环境，进而促进肿瘤的生长发育。不同的是，Huang等[11]研究证实外泌体lncRNA RP11-85G21.1(lnc85)可靶向吸附miR-324-5p，从而阻碍其发挥功能，间接促进下游增殖蛋白与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)2和MMP9的表达，进而诱导HCC肿瘤细胞的增殖、抗凋亡及侵袭迁移能力，且lnc85在AFP阳性和AFP阴性的HCC病人中均呈显著上调表达，表明其可作为区分AFP阴性的HCC与健康对照和肝硬化的独立生物标志物(灵敏度为80.0%，特异度为76.5%)，或与其他肿瘤标志物联合以优化HCC的诊断。Cao等[12]除证实肝癌高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer，HULC)在HCC的病理组织和肿瘤细胞系(HepG2、SMMC7721)中表达异常上调外，还发现HCC病人相比于健康对照组lncRNA HULC在血清外泌体中呈异常高表达。体外细胞实验中利用siRNA-lncRNA HULC转染HCC细胞系实现了肿瘤细胞的增殖和转移侵袭抑制效应并诱导凋亡发生。进一步研究揭示了该现象的潜在机制：lncRNA HULC通过靶向吸附miR-372-3p，解除其与下游靶基因Rab11a3′-非翻译区(untranslated region， UTR)的结合，从而阻碍其发挥功能，间接上调Rab11a基因的表达，进而促进肿瘤的生长发育。此研究为HULC在肝癌中的作用机制提供了新的见解。另外，Wang等[13]研究显示外泌体内高表达的lncRNA H19可靶向吸附miR-520a-3p，解除其与下游靶基因LIM结构域激酶1(LIM domain kinase 1， LIMK1) 3′-UTR的结合，实现LIMK1的上调表达效应，加速丙泊酚处理HCC细胞的增殖、侵袭和迁移并抑制凋亡发生。这些研究描述了肝癌中外泌体lncRNA的表达特征，同时确定了其在细胞增殖与抗凋亡调控中起的重要作用，并促进了外泌体lncRNA相关生物标志物或治疗靶点的开发。

2.外泌体lncRNA参与侵袭与转移 癌细胞的转移往往是恶性肿瘤不良预后的主要原因。长期以来，对肿瘤转移机制的研究主要集中在肿瘤与机体的相互作用上。然而，近年来发现，肿瘤微环境中的外泌体通过在细胞间传递特异性信息，在肿瘤转移中发挥重要作用。Li等[14]研究发现lncRNA ATP-dependent RNA helicase FAL1在HCC组织及HCC肿瘤细胞衍生外泌体内高表达，且高表达组病人总体生存期(overall survival， OS)明显缩短，进一步研究发现lncRNA FAL1可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA， ceRNA)直接结合miR-1236来阻断其与下游靶标锌指E-盒结合同源异形盒(zinc finger E-box binding homebox， ZEB1)和AFP 3′-UTR的结合，抑制miR-1236对ZEB1和AFP表达的负向调控，而高表达的ZEB1和AFP可诱导肿瘤细胞增殖和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)的发生，进而增强其转移侵袭能力。这些发现提示lncRNA FAL1在HCC中起致癌作用，并可能对未来新的诊断生物标志物或新的治疗靶点的开发有重要价值。同样，Gramantieri等[15]研究显示HCC细胞衍生的外泌体lncRNA LUCAT1通过靶向吸附miR-181d-5p从而阻碍其发挥功能，抑制癌细胞的EMT发生，进而降低肿瘤细胞的侵袭潜能，且较高的lncRNA CASC9和lncRNA LUCAT1水平与HCC术后更低的复发率和更长的复发时间相关。Wang等[16]研究发现lncRNA SENP3-EIF4A在HCC组织和血浆外泌体内表达下调，并且其表达水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移密切相关。正常肝细胞分泌的外泌体SENP3-EIF4A可转移至HCC细胞，通过ceRNA机制竞争性结合miR-9-5p，解除其对下游靶基因锌指蛋白36(zinc finger protein 36， ZFP36)的表达抑制，而高表达的ZFP36可诱导细胞凋亡并抑制侵袭和迁移。其结果表明，SENP3-EIF4A1通过外泌体直接从正常细胞转移到HCC细胞，在体外和体内调节HCC的生物学功能。并且，它参与正常细胞和癌细胞在HCC发生期间的通信过程，是临床检测肝癌的一种新的有利生物标志物。

3.外泌体lncRNA参与免疫调节 肿瘤的发生与发展与肿瘤微环境的免疫状态密切相关，外泌体可携带lncRNA参与调控肿瘤免疫微环境，在肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间传递生物活性分子，帮助癌细胞躲避机体自身的免疫监视，诱导免疫耐受。巨噬细胞是先天性免疫防御的关键角色，在肿瘤微环境中越来越受到重视。外源性沉默lncRNA TUC339可增加巨噬细胞中促炎细胞因子的产生并增强共刺激分子表达及其吞噬作用，且lncRNA TUC339表达与M(IL-4)巨噬细胞极化正相关，表明lncRNA TUC339可通过外泌体介导转移至HCC肿瘤微环境内巨噬细胞，参与调控巨噬细胞活化和M1/M2极化，进而诱导肿瘤细胞逃避免疫监视并终止免疫攻击[17]。这项研究不仅加深了我们对lncRNA调节巨噬细胞功能的理解，而且还揭示了肿瘤细胞与天然免疫之间复杂的相互作用关系。不同于巨噬细胞参与免疫调节，程序性死亡蛋白-1(programmed death-1， PD-1)是一种免疫检查点受体，表达于免疫细胞表面，而程序性死亡蛋白配体-1(programmed death-ligand1， PD-L1)和PD-L2是PD-1的配体(PD-Ls)，在多种肿瘤中呈高水平表达。Fan等[18]利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库筛选HCC肿瘤组织和正常肝组织中与PD-L1和PD-L2相关的lncRNAs，其中PCED1B-AS1与其密切相关且丰度最高，同时其在血浆外泌体中也呈上调表达。临床病理数据分析结果显示PCED1B-AS1表达水平与肿瘤数量、癌肿大小、晚期TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)以及病人不良预后密切相关。进一步研究显示HCC细胞释放的外泌体PCED1B-AS1通过靶向吸附hsa-miR-194-5p，以解除其与下游靶基因mRNA3′-UTR的结合，间接促进PD-L1和PD-L2的高表达，实现PCED1B-AS1与PD-L1和PD-L2的同趋势表达，进而诱导受体HCC细胞中PD-Ls介导的免疫抑制并损害受体T细胞和巨噬细胞的细胞活性。免疫调节机制的研究帮助我们从另一个角度理解肿瘤的发生过程，从而发现更多潜在生物标志物和治疗靶点。

4.外泌体lncRNA参与化学耐药性 肿瘤的耐药性是导致治疗失败的常见原因，肿瘤病人在化疗过程中产生耐药性而导致效果欠佳和肿瘤高复发率仍然是亟待解决的问题。近年来，越来越多的研究表明，肿瘤细胞通过分泌含有耐药性lncRNA的外泌体，从而诱导细胞产生对化疗药物的抗性。Takahashi等[19]研究显示转化生长因子-β可降低HCC细胞对索拉非尼或阿霉素的敏感性，并选择性富集HCC细胞源性的外泌体内长链非编码RNA-重编码调控因子(linc-ROR)导致其高表达，同时使具有干细胞表型的肿瘤起始细胞内CD133+表达增加和部分群落生长，进而诱导HCC细胞的化学耐受性。利用siRNA外源性敲低linc-ROR可增加化疗诱导的细胞毒性和细胞凋亡并抑制肝脏肿瘤干细胞的自我更新、自我分化及成球能力。这些发现确定了可能针对HCC的部分介质及其发生机制，有助于增强这些细胞间信号机制和介质的敏感性，并改善其对用于治疗HCC的常规治疗剂的反应。该团队还发现外泌体linc-ROR可作为缺氧反应性lncRNA，可通过miR-145/缺氧诱导因子-1α亚单位(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)信号传导轴与HCC中的缺氧信号传导通路功能性连接，增加下游靶基因miR-145的表达，抑制核糖体s6蛋白激酶1的磷酸化及下调3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和HIF-1α的表达，进而在缺氧应激中延长细胞存活时间[20]。另有研究[21]证实在化疗应激期间，HCC细胞及其分泌的外泌体内linc-VLDLR表达增加，RNA干扰介导的linc-VLDLR基因敲除可抑制三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2， ABCG2)的表达并诱导细胞周期阻滞及降低细胞生存能力，而ABCG2的过度表达可恢复HCC细胞的化疗耐受性。了解化疗耐药机制对于HCC等对化疗药物反应非常差的癌症尤其重要。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，通过阻断多种生长因子发挥抗血管生成和抗肿瘤作用[22]。该化疗药物是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗晚期肝癌的唯一药物，但由于获得性耐药率高，该药物的有效性受到极大限制[23]，确定HCC的化疗耐药机制有可能改善使用索拉非尼等药物治疗肝癌的疗效。

5.外泌体lncRNA参与血管生成 血管生成被认为是肿瘤生长迅速、早期转移和生存不良的主要原因[24]。由于靶向肿瘤血管生成是治疗肝癌的关键，所以研究肝癌血管生成的潜在机制具有重要意义。肝癌干细胞通过分泌外泌体激活信号通路，诱导血管生成使其抵抗低氧环境，而血管微环境又可以分泌生长因子经内分泌途径正反馈作用于肝癌干细胞，加速血管的生成，最终促进肿瘤细胞的增殖与侵袭性细胞表型的形成。Conigliaro等[25]研究显示CD90+肿瘤干细胞样肝细胞(CD90+Huh7)可通过分泌富含lncRNA H19的外泌体实现细胞间基因转移，进而影响受体细胞表型。内皮细胞将CD90+Huh7释放的外泌体吸收内化，过表达的lncRNA H19可促进血管内皮生长因子及其受体、细胞间黏附因子的表达，刺激内皮细胞血管生成并通过促进内皮细胞和CD90+Huh7异型黏附来加速两者的结合。故外泌体可能通过调控靶细胞相关mRNA的转录以促进血管生成，这可能成为减少肝癌复发和转移的新治疗靶点。另外，除了上述通路，Li等[26]研究表明：外泌体SNHG16(long noncoding RNA small nucleolar RNA host gene 16)通过PI3K/Akt/mTOR通路分泌miR-4500来促进人脐静脉内皮细胞活化，并调节GalNT1表达，从而促进肿瘤血管生成。这项研究强调了外泌体在肝癌细胞和内皮细胞之间通信中的重要作用，并提出外泌体SNHG16可作为肝癌抗血管生成的治疗靶点。

二、外泌体lncRNA作为HCC诊断标志物

隐匿性发病和缺乏准确有效的早期诊断性生物标志物是HCC病人低OS的主要原因。传统的诊断标志物，如AFP、AFP-L3、铝岩藻糖苷酶(AFU)和维生素K缺乏或拮抗Ⅱ诱导蛋白质(PIVKA-Ⅱ)，对肝癌的诊断具有较低的敏感性和特异性。而外泌体lncRNA对肿瘤微环境影响广泛，有特异性高、稳定性强、检测便捷等特点，其非创伤性检测方式可作为未来诊断及治疗的理想生物标志物。在外泌体中，发现了10个上调的lncRNA，即LINC00161、ENSG00000248932.1、ENST00000440688.1、ENST00000457302.2、lncRNA-RP11-583F2.2、lncRNA FAM72D-3、lncRNA Jpx、lncRNA ENSG00000258332.1、lncRNA LINC00635、lncRNA HEIH[27-33]，构成HCC中潜在的诊断生物标志物。其中，前9个lncRNA的受试者工作特征曲线下面积(AUC)分别为0.794、0.776、0.612、0.720、0.965、0.584、0.865、0.719、0.750。同时，Matboli等[29]研究证实外泌体lncRNA-RP11-583F2.2(96.7%， 91.7%)在HCC诊断中比AFP(90%，85%)具有更高的灵敏度和特异度，而lncRNA Jpx的灵敏度和特异度分别为91.5%和72.7%，相对较差。外泌体中lncRNA的下调表达也具有很高的诊断价值。Yao等[30]研究显示外泌体中lncRNA EPC1-4表达下调，过表达后可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，其AUC为0.852，表明其可作为HCC诊断的非侵入性循环生物标志物。虽然单个外泌体lncRNA可作为HCC的诊断依据，但对于高危人群，联合生物标志物检测将比单个生物标志物更准确地预测HCC。Xu等[31]比较了55例HCC病人、60例慢性乙型肝炎病人、60例健康对照者的血清外泌体lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的表达水平：HCC组的lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的水平显著高于其他组，且术后两种lncRNA均明显降低，ENSG00000258332.1、LINC00635和AFP的组合区分HCC病人与慢性丙型肝炎病人的AUC为0.894，灵敏度为83.6%，特异度为87.7%。

三、外泌体lncRNA与HCC预后及复发

外泌体lncRNA表达失调与HCC病人的临床病理特征密切相关。准确预测肝癌病人的临床预后有助于指导肝癌治疗决策，从而有效提高病人的生存效益。在外泌体中，有5种与预后相关的lncRNA显著上调，即lncRNA-ATB、lncRNA CTD-2116N20.1、lncRNA RP11538D16.2、lncRNA CRNDE、lncRNA ASMTL-AS1[34-37]，所有这些高表达的lncRNA已被证实是肝癌预后不良的潜在生物标志物。临床上，外泌体中lncRNA-ATB的表达水平与TNM分期及门静脉血栓形成密切相关[34]，而lncRNA CRNDE过表达在肿瘤较大、分化较差、TNM分期晚期的HCC病人中更为常见[36]，ASMTL-AS1表达与肝癌分期、转移及预后有关[37]。其中Lee等[34]报道更高的lncRNA-ATB表达提示更短的OS和无进展生存期(progress free survival， PFS)，进一步Cox回归多因素分析显示：lncRNA-ATB表达上调、肿瘤体积增大、C-反应蛋白升高可作为肿瘤进展或死亡的独立预测因子。同样，Hou等[35]研究的Kaplan-Meier生存曲线表明lncRNA CTD-2116N20.1和lncRNA RP11538D16.2过度表达的病人OS和PFS较短(P<0.05)，二者可通过调节外泌体中蛋白质的表达水平导致HCC病人预后不良。此外，血清外泌体lncRNA CRNDE表达较低的病人的OS和 DFS显著延长，进一步的单因素和多因素分析表明，高血清外泌体lncRNA CRNDE表达是预后不良的独立指标[36]。Ma等[37]研究表明，外泌体lncRNA ASMTL-AS1通过miR-342-3p/NLK/YAP信号轴加重射频消融不足后残留HCC的恶性程度，为射频消融不足后肝癌的治疗和预防残留肝癌的复发或转移提供了新思路。

四、小结与展望

综上所述，外泌体可通过携带各种lncRNA参与介导肿瘤细胞与周围细胞的信息交流，进而不同程度地影响肿瘤的发生发展，同时外泌体lncRNA通过调控细胞信号通路促进肿瘤细胞的增殖与侵袭迁移能力，刺激血管生成及化疗耐受性的产生，并可作为HCC诊断和预后的评估指标。然而外泌体lncRNA在HCC中的研究仍较少：当前已发现的外泌体携带的lncRNA较少，且外泌体装载lncRNA的机制未清晰；关于外泌体lncRNA应用于临床的研究仍处于起步阶段，且外泌体lncRNA作为HCC新型生物标志物的特异性还需进一步提高。不过相信随着新技术的不断出现及对外泌体研究的深入，人类对HCC的治疗效果将大大改善。

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