李 丹,胡晓红,徐新娟,杜德兵,吴文艳,王德成,庄 倩,陈志杰,金 柱
(1. 宜昌市第三人民医院肺病科,湖北 宜昌 443003;2. 三峡大学感染与炎症损伤研究所,湖北 宜昌 443002;3. 三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002)
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种危害严重的传染病,根据世界卫生组织(WHO)最新报道,2020年全球新发结核病病例约1 000万,我国超过83万,依然是全球30个结核病高负担国家之一[1]。在结核分枝杆菌感染与传播过程中,某些基因型菌株致病性强、传播速度快且适应性强,容易引起大范围广泛传播和流行,对结核病的流行至关重要。大量数据证实北京基因型菌株是具有相似遗传背景和高致病性与传播力的代表,该菌株已在世界多地传播和流行[2-4],我国也屡有相关报道[5-11]。北京基因型菌株是结核分枝杆菌家族中传播迅速和致病性强的一类优势菌株,由于不同地域结核病的流行病学差异,不同地域来源的北京家族菌株的特征也不尽相同。Supply等根据结核分枝杆菌基因组DNA中特定位点的数目可变串连重复序列技术(variable-number tandem repeat, VNTR)建立的基因型分型方法[12],经过不断改进和优化后已广泛应用于结核病分子流行病学研究[6-8, 10-11, 13-15]。联合VNTR分型结果、临床信息及流行病学数据,可将结核病的传播链与分子流行病学研究有机连接,对了解结核病的传播动态十分有价值。
宜昌位于我国中西部地区,结核病历年位居地区传染病报告发病率前三位,已成为威胁本地区人民健康和社会经济发展的重大公共卫生问题。北京基因型菌株是结核分枝杆菌家族最重要的成员。收集本地区结核分枝杆菌菌株进行鉴定和分型,研究本地区北京基因型菌株的多态性,既能揭示本地区北京基因型菌株的分子流行病学特征,也能认识和预测结核病的发生和传播模式,最终为建立适宜本地区的结核病监测平台和制定相应的结核病防控策略提供科学依据。
1.1 菌株来源 收集2018年1月—2019年12月宜昌地区(含下辖区县)的结核分枝杆菌菌株,纳入标准为痰抗酸染色阳性或痰结核分枝杆菌培养阳性,并根据菌株信息核对患者的流行病学资料、年龄、性别、病史资料等信息[16],最终获得具有完整患者信息的菌株共计298株。标准菌株H37Rv购自中国药品生物制品检定所。
1.2 药敏试验 所有菌株接种罗氏培养基复种后,采用比例法对4种抗结核药物进行药敏试验,培养基内药物的终浓度分别为:异烟肼(INH)0.2 μg/mL,利福平(RFP)40 μg/mL,乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL,链霉素(SM)4 μg/mL。耐药标准:含药培养基菌落数/对照培养基菌落数≥1%即为耐药。
1.3 北京基因型菌株鉴定 所有菌株接种罗氏培养基复种,采用煮沸法提取细菌基因组DNA。按照下述方法操作鉴定菌株是否为北京基因型。第一步设计4条引物(表1中1~4号),PCR扩增后,凝胶电泳比较产物大小,如果扩增出850 bp和361 bp两条带,则说明标本DNA属于人型结核分枝杆菌,据此筛选出298个标本中人型结核分枝杆菌并进行北京基因型菌株的鉴定。RD105区域缺失是北京基因型菌株所特有,针对RD105区域设计引物进行多重PCR扩增鉴定北京基因型菌株。根据Chen等[17]建立的RD105缺失片段的DTM-PCR检测方法,设计3条引物序列(表1中5~7号),PCR扩增后比较电泳产物,如果只能扩增出1 495 bp条带,则是非北京基因型菌株;如果扩增出786 bp的条带,该标本则是北京基因型。电泳结束后在紫外凝胶成像分析系统下观察结果,以国际参考菌株 H37Rv作为对照。
表1 PCR引物序列
1.4 数据分析
1.4.1 分析方法 将所有北京基因型菌株VNTR位点的重复次数输入https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index网站,获得VNTR分型结果,各VNTR位点的分辨率和总分辨率用Hunter-Gaston指数表示,计算公式为:
其中,n为总的菌株数,s为获得的基因型总数,nj为某基因型的菌株数。
1.4.2 成簇结果分析VNTR分型根据文献[18-20]方法进行优化 VNTR重复单元数目计算公式如下,各VNTR重复单元数目=(PCR产物长度-各VNTR侧翼片段长度)/重复单元长度。两个或两个以上的北京基因型菌株具有完全相同的VNTR图谱,既认为是成簇菌株。
1.5 统计学处理分析 应用SPSS 20.0 统计软件进行分析,计数资料以百分率(%)表示,组间比较采用χ2检验,P≤0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 北京基因型菌株鉴定结果 共获得298株临床菌株,其中260株(占87.25%)鉴定为人型结核分枝杆菌,见图1;DTM-PCR分型结果发现,260株结核分枝杆菌中,140株(53.85%)属于北京基因型菌株,见图2。
注:M为DNA Marker,1~10为结核分枝杆菌的标本,电泳检测出现850、361 bp 两条带,说明模板DNA 是人型结核分枝杆菌,只扩增出850 bp条带的标本4和10则属于结核分枝杆菌复合群,不是人型结核分枝杆菌。
注:M为DNA Marker,1~10为结核分枝杆菌的标本,电泳检测出现786 bp条带的标本,则为北京基因型菌株,而出现1 495 bp的标本为非北京基因型菌株。
2.2 临床菌株基本信息 分析260株人型结核分枝菌株来源的患者信息,其中162例男性,98 例女性患者;年龄范围为 14~82岁,平均年龄49岁。<30岁、30~岁、45~岁和>60岁患者分别为24、60、97、79例,各年龄组感染北京基因型菌株的比率分别为9.28%、22.86%、36.43%、31.43%,北京基因型菌株和非北京基因型菌株感染患者性别、年龄以及治疗史各组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),见表2。
2.3 临床菌株药敏试验结果 对260株人型结核分枝杆菌进行一线抗结核药药敏试验,4种抗结核药中,总体耐药率由高至低依次为:INH>RFP>EMB>SM;北京基因型菌株耐药率 (32.14%) 高于非北京基因型菌株耐药率(10.83%),差异有统计学意义(P=0.007)。见表3。
2.4 VNTR基因分型 VNTR-9位点(QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372)的分辨能力见表4,其中QUB-11b、QUB-18、QUB-26显示较高的HGI,而VNTR2372显示较低的HGI,VNTR-9位点的HGI为0.998 5。VNTR-9位点的分型结果显示,140株北京基因型菌株呈明显的多态性(见图3),根据MIRU-VNTR位点规则,发现有3组成簇菌株,其中一个基因簇包含8株菌株,成簇率为12.15%。
图3 140株北京基因型菌株聚类分析图谱
结核分枝杆菌北京基因型家族易导致大范围感染与流行,基因型鉴定和分型相关研究引起了广泛关注。相较于传统针对IS6110序列的RFLP和spoligotyping鉴定手段,Chen等[17]建立的DTM-PCR鉴定方法操作简单。北京基因型家族菌株缺乏RD105区域,而非北京基因型菌株保留有该区域,因此针对RD105区域设计引物进行多重扩增,能获得不同长度的DNA片段,以区分北京基因型或非北京基因型。该方法简单、高效,已广泛应用于北京基因型菌株的鉴定[8-10, 21-25]。本研究对260株人型结核分枝杆菌进行DTM-PCR检测,发现140株为北京基因型菌株,与丁冰冰等[26]报道武汉地区所选的85株菌株中91.8%(78株)为北京基因型菌株存在一定差异。本研究首次对宜昌地区北京基因型菌株进行鉴定,结果表明北京基因菌株在该地区的感染与发病中占据优势地位,同时也需要关注非北京基因型菌株相关研究。
北京基因型菌株是耐药结核病流行的重要原因。本研究结果显示,北京基因型菌株耐药率 (32.14%),与全国的调查结果基本一致(33.10%),高于非北京基因型菌株耐药率(10.83%),结果显示宜昌地区结核分枝杆菌的耐药性以北京基因型菌株为主,研究结果对指导本地耐药结核病的防控具有重大意义。由于结核分枝杆菌受宿主因素和环境因素等多因素影响,关于宜昌地区北京基因型菌株的生物学特征还需进一步探索。
VNTR已广泛应用于对北京基因型菌株的分型和成簇的研究。Mazars选择了VNTR-12位点对来自美国的72株结核分枝杆菌进行分型,发现VNTR-12位点的分辨率高于IS6110-RFLP[27]。Supply基于全球结核分枝杆菌菌株信息大量数据,对VNTR-12分型技术进行了改进,推出了VNTR-15及-24位点的分型技术[12]。随着VNTR-12、15及24位点分型技术的应用,研究者发现这些位点是针对所有来源的菌株,但对北京基因型菌株的识别能力尚有不足。Zhang等[20]针对北京基因型菌株的特点,比较45个用于北京基因型菌株分型的VNTR位点的分辨率,最后推荐VNTR-7和VNTR-16位点可作为北京基因型菌株的分型。后续研究对VNTR-7和VNTR-16位点进一步进行优化,发现VNTR-9位点对结核分枝杆菌北京基因型菌株具有较好的识别能力[18],目前已得到广泛应用[28-30]。本研究中发现QUB-11b位点的识别能力最强,且总HGI为0.998 5,说明该方法对本地区北京基因型菌株具有较高的分辨能力。
本研究首次运用DTM-PCR和VNTR-9位点技术对宜昌地区的北京基因型菌株进行鉴定和分型,相对于刘晓俊等[31]采用的VNTR-24位点对2016—2017年宜昌地区收集的367株结核分枝杆菌的分型结果,本研究重点对该地区北京基因型菌株进行了鉴定和分型,结果表明目前本地区的北京基因型菌株仍然处于流行的优势地位。另外,使用VNTR-24分型方法,位点多、操作繁琐,且部分位点不适合于本地区菌株的检测。本研究中采用DTM-PCR和VNTR-9位点对北京基因型菌株具有较高的鉴定和分型能力,操作简单,节约时间和操作成本,适用于本地区结核分枝杆菌北京基因型菌株的快速鉴定和分型,为宜昌地区北京基因型菌株分子流行病学的研究和结核病防治提供科学依据。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。