紫花苜蓿根茎叶对三种常见细菌的抑制作用研究

刘桂萍，王 宇，李思宇，亢佳彤

(辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117004)

紫花苜蓿(Medicago sativa Linn)为豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Faboideae)，苜蓿属(Medicago L.)多年生草本，世界上种植面积最大、种植时间最久的优良豆科牧草，以其营养丰富，消化率高，适应性好得名“牧草之王”[1-2]。近年来的研究发现，紫花苜蓿营养丰富，具有较高的利用价值，在医药、农业和畜牧业中均占有一定的地位，是迄今发现的营养最全面的草本植物之一[3-4]。紫花苜蓿含有多种生物活性成分，包括黄酮、皂苷、叶蛋白、多糖等[5-6]，随着研究的深入，其各种重要成分的提取方法也在不断完善[7-9]。

本文研究的目的在于探索紫花苜蓿粗提物的抑菌性，为紫花苜蓿的开发及综合利用提供一定的借鉴。实验设计思路为：从紫花苜蓿的根茎叶中分别提取皂苷和黄酮类物质的粗提物→设定不同浓度梯度的粗提液→对3种常见细菌展开抑菌实验→分析抑菌性。

1 紫花苜蓿样品处理与抑菌实验菌种的选择

1.1 紫花苜蓿样品处理

本实验所需样品为紫花苜蓿完整植株，于2020年9月采摘于辽宁科技学院校园内。紫花苜蓿采摘后进行根、茎、叶分离，再分别称量其重量得到湿重，然后放入电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干12 h，烘干后称量并记录各部位样品的干重。然后再研磨粉碎，过2 mm大小的孔筛进行过筛处理得到粉末，称重后放入药品瓶中用自封袋封好备用。

1.2 抑菌实验菌种的选择

本实验选用三种常见细菌，即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为抑菌实验菌种，所用菌种均由辽宁科技学院生物医药与化学工程院微生物实验室提供。

2 紫花苜蓿根茎叶中两种成分的粗提取

2.1 紫花苜蓿根茎叶中黄酮类物质的粗提取

分别准确称取紫花苜蓿根、茎、叶粉末各10 g，转移至500 mL烧杯中，并加人55%乙醇450 mL，用保鲜膜封口静置，在室温下浸泡5 h[10]。

浸泡完成后，将烧杯转移至超声波粉碎机中，超声处理20 min(如图1所示)。

图1 用超声波粉碎机处理浸泡液

超声结束后，将烧杯中的液体转入带有滤纸的漏斗中，用循环水真空泵将液体和粉末的混合物减压抽滤得到紫花苜蓿不同部位黄酮类物质的粗提液，再将粗提液转入旋转蒸发仪中，水温设置30 ℃，减压浓缩成干浸膏(如图2和图3所示)，最后称取干浸膏的质量。

图2 用循环水真空泵对样品进行抽滤

图3 用旋转蒸发仪对样品进行减压浓缩

2.2 紫花苜蓿根茎叶中皂苷的粗提取

分别准确称取紫花苜蓿根、茎、叶粉末各5 g，用滤纸将粉末包裹严实，再用白线捆绑紧，然后把包裹着粉末的滤纸包放到索氏提取器的管道中，用试管架将索氏提取器固定在水浴锅上方，再向底部的烧瓶中加入150 mL 70%乙醇溶液，把底部的烧瓶放到90 ℃的水浴锅中进行水浴加热，提取液开始回流，待回流3次后拿出索氏提取器，取出紫花苜蓿根部样品的皂苷粗提液[11](如图4所示)。

图4 用索式提取器进行样品提取

将各项提取液分别减压浓缩成干浸膏，再将其溶于蒸馏水中，过滤掉不溶物后加入相同体积的石油醚进行萃取(如图5所示)，由于石油醚是亲脂性溶剂，亲脂性杂质会溶解在石油醚中，而皂苷在强亲脂性溶剂中几乎不溶解，仍处于水相中，由于水的密度大于石油醚的密度，所以打开阀门，保留下层液体[12]。

图5 萃取紫花苜蓿叶中皂苷成分

再用正丁醇进行萃取，正丁醇的亲水性较强，所以一些亲水性强的杂质便留在了水相中，而皂苷则转溶于正丁醇中，由于正丁醇密度小于水的密度，所以放出下层液体，再将上层液体从分液漏斗的上部倒出。将倒出的提取液减压浓缩溶液成干浸膏，即获得紫花苜蓿各部位的皂苷粗品。

3 紫花苜蓿根茎叶中两种成分的抑菌效果

3.1 紫花苜蓿根茎叶中两种成分提取物的稀释及无菌化处理

黄酮类物质的种类繁多，有水溶性和脂溶性两种，本实验先用无菌水进行黄酮类物质的溶解，通过搅拌，发现黄酮类物质的粗提物可以溶解于水中。同样，皂苷也是水溶性物质。在无菌室的超净工作台上将两种物质用无菌水进行溶解，由于滤菌膜过滤的浓度有限，所以一点点稀释成滤菌膜所能承受的最大浓度。然后再用二倍梯度稀释法稀释粗提液，将紫花苜蓿根茎叶各部分不同成分提取物稀释成5个不同的浓度梯度(如表1所示)，再用一次性注射器取稀释好的粗提液，取下针头，通过滤菌膜上部将提取液打入小试剂瓶中，再用瓶塞盖好。注意操作前要将手用75%的乙醇消毒，并严格按照无菌操作进行，以防粗提液染菌影响实验结果。

表1 紫花苜蓿根茎叶各部分不同成分提取物

续表1

3.2 抑菌圈直接的判定标准

本实验采用滤纸片法测定各成分不同浓度粗提液的抑菌效果，具体操作流程为：制备培养基，涂布菌悬液→放置对照组及含各成分不同浓度粗提液的滤纸片于上一步的培养皿中→恒温培养→测量抑菌圈直径并做好数据记录。

规定抑菌直径≥20 mm为高等灵敏度；抑菌圈直径15 mm到20 mm为中等灵敏度；抑菌圈直径11 mm到15 mm为低等灵敏度；抑菌圈≤11 mm为耐药[12]。

3.3 紫花苜蓿根茎叶粗提物对三种细菌抑菌效果

3.3.1 紫花苜蓿根茎叶黄酮类粗提物的抑菌效果

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的黄酮类物质对大肠杆菌的生长抑制效果如表2所示。

表2 黄酮类物质对大肠杆菌的抑菌效果

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的黄酮类物质对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果如表3所示。

表3 黄酮类物质对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的黄酮类物质对枯草芽孢杆菌的生长抑制效果如表4所示。

表4 黄酮类物质对枯草芽孢杆菌的抑菌效果

3.3.2 紫花苜蓿根茎叶皂苷粗提物的抑菌效果

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的皂苷对大肠杆菌的生长抑制效果如表5所示。

表5 皂苷对大肠杆菌的抑菌效果

续表5

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的皂苷对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果如表6所示。

表6 皂苷对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

紫花苜蓿根茎叶三个不同部位所提取的皂苷对枯草芽孢杆菌的生长抑制效果如表7所示。

表7 皂苷对枯草芽孢杆菌的抑菌效果

4 结论

本实验结果显示，紫花苜蓿根茎叶中黄酮类物质和皂苷两种不同成分的粗提物对三种细菌的抑菌效果并不十分明显，其中紫花苜蓿茎中的黄酮类物质对大肠杆菌的抑菌效果优于根和叶的抑菌效果；紫花苜蓿根中的黄酮类物质对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于茎和叶的抑菌效果；紫花苜蓿茎中的黄酮类物质对枯草芽孢杆菌的抑菌效果优于根和叶的抑菌效果；紫花苜蓿根中的皂苷对大肠杆菌的抑菌效果优于叶和茎的抑菌效果；紫花苜蓿叶中的皂苷对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于根和茎的抑菌效果；紫花苜蓿根中的皂苷对枯草芽孢杆菌的抑菌效果优于茎和叶的抑菌效果。总结得到最终结论：紫花苜蓿中的黄酮类物质抑菌效果为：茎﹥根﹥叶；紫花苜蓿中的皂苷物质抑菌效果为：根﹥叶﹥茎。