非人灵长类动物种质冷冻保存研究进展和展望

李明文

（新乡医学院三全学院生育力保存实验室，新乡 453003）

非人灵长类是最高等的动物类群和人类的近亲，在形态、生理、生殖、发育、行为和遗传等诸方面与人类高度近似，因此是研究生物医学和人类疾病的理想动物模型，长期以来供不应求(Changet al.,2021)。非人灵长类动物虽然种类繁多，包括原猴、新大陆猴、旧大陆猴和巨猿等类群，约500余种(Rylands and Mittermeier,2014；尹峰等，2015;Zinner and Roos,2016)，但是由于人类活动、栖息地破坏、狩猎、遗传隔离和气候变化等因素，许多非人灵长类动物的野生种群数量急剧下降，其中不少濒临灭绝的边缘(马世来和王应祥，1988；张荣祖等，1992；范朋飞，2012)。

中国的非人灵长类动物除猕猴(Macaca mulatta)为国家二级重点保护野生动物外，其余均被列为国家一级重点保护野生动物，处于易危、濒危或极危等级(范朋飞，2012；尹峰等，2015;Zinner and Roos,2016；中国野生动物保护协会，2020)，其中最为濒危的是长臂猿类，例如中国特有的海南长臂猿(Nomascus hainanus)和天行长臂猿(Hoolock tianxing)，种群数量分别只有约33只和200只，濒临灭绝的边缘。原猴类的蜂猴(Nycticebus bengalensis)和倭蜂猴(Nycticebus pygmae-us)也处于极危等级，前者种群数量为800~1 200只，后者只有100只左右。疣猴类状况也不容乐观，滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)和黔金丝猴(Rhinopithecus brelichi)每种数量少于2 000只，黑叶猴(Presbytis francoisi)约1 600只，白头叶猴(Trachypithecus leucocephalus)约1 200只，而戴帽叶猴(Presbytis pileatus)只剩约300只。猕猴属一些种类也亟需加强保护，例如中国特有的藏酋猴(Macaca thibetana)的种群数量约为2 000只，藏南猕猴(Macaca munzala)估计少于500只，而白颊猕猴(Macaca leucogenys)则数量不详。

为了保护非人灵长类动物和拯救濒危物种，除了建立野生动物保护区和对一些物种进行异地圈养外，近几十年还对一些物种的生殖生物学、辅助生殖和种质冷冻保存进行了研究。辅助生殖包括人工授精、体外受精、精子卵胞浆显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)和胚胎移植等，是拯救动物和提高繁殖效率的重要手段(Mazuret al.,2008;Comizzoli,2017)。为了方便和有效地进行辅助生殖，常常需要对精子、卵子和胚胎等生殖材料进行冷冻保存，在需要时进行复苏和用于辅助生殖。生殖材料的冷冻保存还包括对含有生殖干细胞和生殖细胞的性腺组织(睾丸组织和卵巢组织)的冷冻保存。由于生殖材料的冷冻保存与生殖密切有关，故常被称为种质保存(germplasm preservation)(Mazuret al.,2008;Luvoni and Colombo,2020)或生育力保存(fertility preservation)(Comizzoli,2017;Picton,2018;Changet al.,2021)。种质冷冻保存与辅助生殖相结合对保存动物遗传物质资源、拯救濒危动物、提高繁殖效率和在圈养种群中增加遗传多样性等具有重要意义(Mazuret al.,2008;Comizzoli,2017;Luvoni and Colombo,2020)，另外还是保存基因编辑非人灵长类动物品系的重要方法(Changet al.,2021)。

冷冻保存一般是将细胞或组织在冷冻保护剂的存在下，经过适当的脱水(以避免冰晶损伤)和降温处理后，放置于液氮的超低温度(-196℃)下，使其生物活动有效停止，并同时使其结构和功能得以长期保存(Pegg,2015;Fahy and Wowk,2021)。根据对生物膜通透性的不同，冷冻保护剂分为膜通透性保护剂(如乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜和甘油)和膜非通透性保护剂(如蔗糖、海藻糖)。种质冷冻保存常用的方法包括慢速冷冻和玻璃化，而玻璃化又根据冷却速率的不同分为快速冷冻(rapid freezing)和超快速冷冻(ultra-rapid freezing)，前者是先在液氮蒸汽内进行冷却，然后浸入液氮，而后者则是直接浸入液氮冷冻保存。

慢速冷冻方法采用较低浓度的冷冻保护剂和缓慢的冷却速率，使细胞逐步脱水，以防止细胞内结冰。慢速冷冻方法一般在结冰温度到来之前的-6℃~-7℃对冷冻样品进行人工植冰(seeding)，以避免过冷现象(supercooling)的伤害(Pegg,2015)。与慢速冷冻方法相比，玻璃化冷冻方法采用高浓度的冷冻保护剂，并迅速把样品冷却到玻璃化转变温度(glass transition temperature)以下，使冷冻液迅速转化为高度粘稠的固体状态，即玻璃化状态，从而避免了细胞内、外冰晶的形成(Fahy and Wowk,2021)。为了避免过高浓度的单一冷冻保护剂的伤害，常混合使用两种或多种冷冻保护剂。

目前，非人灵长类动物种质冷冻保存研究涉及的物种还很有限，主要集中于旧大陆猴的一些种类，例如猕猴、食蟹猴(Macaca fascicularis)和狒狒属(Papio)。近年来对新大陆猴种质保存的研究也逐渐增多，例如狨猴和松鼠猴精子的冷冻保存，但对原猴类动物种质保存的研究仍属空白，只是初步研究了灰鼠狐猴(Microcebus murinus)精液的基本特征(Aslamet al.,2002)，杂色狐猴(Varecia variegata)和环尾狐猴(Lemur catta)的精液采集方法(Chatfieldet al.,2007)以及棕色狐猴(Eulemur fulvus)精子形态的季节性变化等(Brun and Rumpler,1990)。本文主要综述新大陆猴、旧大陆猴和巨猿类的精子、卵子(也称卵或卵母细胞)、胚胎和性腺组织冷冻保存的研究进展，并对未来的研究方向进行了探讨。

1 新大陆猴种质冷冻保存

新大陆猴，也称阔鼻猴，分布于中、南美洲和墨西哥的热带地区，包括狨猴属(Callithrix)、狮面狨猴属(Leontopithecus)、松鼠猴属(Saimiri)、卷尾猴属(Cebus)、节尾猴属(Callimico)、夜猴属(Aotus)、僧面猴属(Pithecia)、丛尾猴属(Chiropotes)、秃猴属(Cacajao)、伶猴属(Callicebus)、吼猴属(Alouatta)和蜘蛛猴属(Ateles)等多个类群。迄今为止，对新大陆猴的种质保存研究主要集中在狨猴、卷尾猴和松鼠猴3个类群，且主要限于精子的冷冻保存。

最近对普通狨猴(Callithrix jacchus)和黑铅笔狨猴(Callithrix penicillate)的研究发现，狨猴类动物精子对低温和冷冻极其敏感，新鲜精子活力(即运动精子的百分数)可达80%以上，但是冷冻保存和解冻后精子的活力只有0~5%(Arakakiet al.,2019a)。该研究采用先慢速平衡、后快速冷冻的方法，以TES-TRIS(即TEST)做为冷冻液的缓冲剂，以棉籽糖、鸡蛋黄和甘油做为冷冻保护剂，冷冻液配方为1.2% Tes、0.2% Tris、2%葡萄糖、2%乳糖、0.2%棉籽糖(质量百分比w/v，下同)、20%鸡蛋黄和4%~6%甘油(体积百分比v/v，下同)。冷冻前把装载到冷冻麦管内的精子样品在2 h内从室温缓慢降低到4℃，然后进行快速冷冻，即先在接近液氮面上方的液氮蒸汽内快速冷冻10 min，最后浸入液氮保存。

采用与上述狨猴属精子冷冻保存相似的方法，对松鼠猴属的柯林斯松鼠猴(Saimiri collinsi)、黑松鼠猴(Saimiri vanzolinii)、洪堡松鼠猴(Saimiri cassiquiarensis)和厄瓜多尔松鼠猴(Saimiri macrodon)的研究发现，松鼠猴精子对低温变化和冷冻也很敏感，鸡蛋黄和甘油对精子活力的冷冻保存效果不佳，解冻后精子的活力由冷冻前的80%~90%降低到6%~30%(Oliveiraet al.,2015,2016)，这与狨猴精子的冷冻生物学特性近似(Arakakiet al.,2019a)。

对卷尾猴类棕卷尾猴(Cebus apella)和簇绒卷尾猴(Sapajus apella)的研究发现，以3.0%~3.5%甘油和10%~20%鸡蛋黄(v/v)做为冷冻保护剂，先将精子在4℃平衡2 h，然后将其放在较高的温度下(-60℃或者离液氮面5~10 cm处)停留20 min，使其进行较慢速的冷冻，然后浸入液氮保存，采用此法可以有效地冷冻保存精子的活力(Oliveiraet al.,2011;Leãoet al.,2015)。和新鲜精子的活力(80%左右)相比，解冻后的精子活力为30%~50%，这与在人类和旧大陆猴(如猕猴和食蟹猴)采用快速冷冻法获得的精液冷冻实验结果近似(Tollneret al.,1990;Sánchez-Partidaet al.,2000;Siet al.,2004;Nichols and Bavister,2006;Dong and VandeVoort,2009;Donget al.,2009)。对金头狮面狨猴(Leontopithecus chrysomelas)的研究也发现较慢速的冷冻速度有利于保存精子活力(Arakakiet al.,2019b)。精子在4℃平衡2 h后，采用6%甘油和10%鸡蛋黄以及较慢速的冷冻方法(将精子样品置于液氮面上方5 cm处液氮蒸汽内10 min)，最后浸入液氮保存。精子在37℃解冻后，精子活力达50%以上。

上述在狨猴、狮面狨猴、松鼠猴和卷尾猴的研究结果表明，新大陆猴的精子对快速降温较为敏感，因此冷冻保存需要较慢的冷冻速度。目前尚无新大陆猴卵子冷冻保存的研究报道，不过已经发现普通狨猴卵母细胞可在体外成熟(Tomiokaet al.,2012)，也可以通过注射卵泡刺激素(FSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)促进卵母细胞在体内成熟(Kroppet al.,2017;Kandaet al.,2018)。胚胎可在动物自然交配后从输卵管或子宫内采集，也可利用人工诱导排卵和体外受精的方法在体外进行生产(Summerset al.,1987;Ishibashiet al.,2013;Kroppet al.,2017)。

对普通狨猴胚胎的研究发现，从输卵管获得的分裂期胚胎(4~10个细胞阶段)和从子宫获得的桑葚胚，在含有20%胎牛血清和1.5 mol/L二甲基亚砜(DMSO)的冷冻液中进行慢速冷冻，可成功使胚胎得到冷冻保存(Summerset al.,1987)，这与在人类和食蟹猴获得的胚胎冷冻实验结果近似(Popeet al.,1986;Balmacedaet al.,1986)。胚胎复苏后进行胚胎移植，可使同步发情的雌性受体正常怀孕，怀孕率55.6%(Summerset al.,1987)。慢速冷冻步骤依次包括室温平衡10 min，然后以每分钟2℃的冷却速率从室温降至-6℃，接着人工植冰，再以每分钟0.3℃的冷却速率从-6℃降至-60℃，最后快速浸入液氮(-196℃)保存(Summerset al.,1987)。

2 旧大陆猴种质冷冻保存

旧大陆猴，又称狭鼻猴，主要分布于非洲和亚洲，包括猕猴类和疣猴类。主要有猕猴、食蟹猴、台湾猕猴(Macaca cyclopis)、日本猕猴(Macaca fuscata)、狒狒、长尾猴属(Cercopithecus)、赤猴(Erythrocebus pata)、绿猴属(Chlorocebus)、白眉猴属(Cercocebus)、白睑猴属(Lophocebus)、山魈属(Mandrillus)、疣猴属(Colobus)、叶猴属(Presbytis)、乌叶猴属(Trachypithecus)、白臀叶猴属(Pygathrix)和仰鼻猴属(Rhinopithecus)等。迄今为止，对旧大陆猴的种质保存研究主要涉及猕猴、食蟹猴、黑长尾猴(Cercopithecus aethiops)和黑冠白睑猴(Lophocebus aterrimus)，而对本类群其他物种的研究极度欠缺。

2.1 精子冷冻保存

对猕猴精液冷冻保存的系统研究始于2000年左右，冷冻液常以TEST作为基础液，鸡蛋黄(常用浓度为20%，v/v)和甘油(常用浓度为3%~5%，v/v)是最常用的冷冻保护剂。冷冻方法包括慢速冷冻和快速冷冻(Sánchez-Partidaet al.,2000;Siet al.,2004；采克俊等，2005;Nichols and Bavister,2006;Donget al.,2009;Dong and VandeVoort,2009)，但两种冷冻方法均先将精子样品从室温缓慢降温至4℃~5℃，以免发生冷休克和精子损伤，具体方法是将精子悬浮于不含甘油的冷冻液内，并将容器放入满盛室温水的烧杯内，然后于4℃平衡2 h。平衡后加入甘油，装入冷冻容器(如冷冻麦管)进行冷冻。快速冷冻方法是把样品放置在离液氮面1.0~1.5 cm的液氮蒸汽中冷却10 min，最后浸入液氮保存(-196℃)。解冻方法一般在37℃水浴内进行(Donget al.,2009)。

研究还发现相同浓度(v/v)的甘油和乙二醇(ethylene glycol,EG)在20%鸡蛋黄的存在下对猕猴精子的冷冻保护作用近似(Donget al.,2009)，这和食蟹猴精子的冷冻保存结果一致(Chenet al.,2017;Strelchenkoet al.,2020)。进一步的研究发现，鸡蛋黄对精子起冷冻保护作用的主要有效成分是低密度脂蛋白(LDL)(Donget al.,2011)，并且鸡蛋黄的浓度不必是20%，因为在2%~20%(v/v)浓度范围内其对精子活力的冷冻保护效果并无显著区别(Donget al.,2009)。最近的研究还发现，超快速冷冻方法(即将精子样品直接浸入液氮，不在液氮气相中停留)不适合猕猴精子，解冻后精子活力几乎为零(de Carvalhoet al.,2021)。

食蟹猴由于全年繁殖(Tollneret al.,1990；王宏等，2017)，也是常用的非人灵长类实验动物。早在1990年代的研究就发现含有20%鸡蛋黄和3%甘油的TEST是食蟹猴精子的有效冷冻液(Tollneret al.,1990)，并且上述的猕猴精子冷冻保存方法对食蟹猴精子同样有效，解冻后精子活力平均达56.0%，这和在猕猴获得的结果相似(Donget al.,2009;Tollneret al.,2011)。如果在含有20%鸡蛋黄和3%甘油的冷冻液内另加20%(v/v)脱脂牛奶，解冻后的精子活力更好，可达67.0%(Tollneret al.,1990)。

除了食蟹猴和猕猴外，对黑长尾猴的研究也发现含有鸡蛋黄和甘油的TEST冷冻液可以有效地冷冻保存精子，解冻后的精子活力可达冷冻前新鲜精子活力的63.6%(Seieret al.,1993)。另外，最近对黑冠白睑猴的研究发现，精子样品在快速冷冻前于15℃~20℃平衡10 min即可，不必像上述对猕猴和食蟹猴等动物的精子那样在快速冷冻前先将精子样品在2 h内缓慢从室温降至4℃~5℃。采用这种快速平衡和快速冷冻的方法，黑冠白睑猴的精子在冷冻保存和解冻复苏后，其精子活力高达67.0%(Gadeaet al.,2019)。

由于蛋黄和牛奶成分复杂，且可能含有动物源性微生物，因此研究化学成分确定的精子冷冻液具有重要意义。Li等(2005)研究了在不含蛋黄和牛奶的情况下采用TEST+甘油冷冻液，发现5%甘油对食蟹猴精子的快速冷冻保存具有最佳的保护作用，解冻后精子活力平均为43.0%。Strelchenko等(2020)采用Tes(52 mmol/L)和哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES,16 mmol/L)作为缓冲剂和含有海藻糖(58 mmol/L)、棉籽糖(4 mmol/L)、葡萄糖(111 mmol/L)、脯氨酸(5 mmol/L)、甘氨酸(10 mmol/L)、谷氨酰胺(10 mmol/L)和人血清白蛋白(9.1%,w/v)的冷冻液，对食蟹猴精子进行了快速冷冻，发现5%(v/v)甘油对精子存活度和精子活力的冷冻保护作用效果最佳，解冻后精子的活力平均为51.6%。

2.2 卵子和胚胎冷冻保存

目前对旧大陆猴卵子冷冻保存的研究很少。早期的研究表明，猕猴未成熟卵母细胞比成熟卵母细胞对乙二醇高渗溶液造成的损伤更具有耐受性(VandeVoort and Leibo,2005)，并且快速冷冻比慢速冷冻能更好地保存卵母细胞的微管等结构(VandeVoortet al.,2008)。黄璋琼等(2014)分别对食蟹猴和猕猴卵母细胞进行了玻璃化冷冻保存研究，解冻后对生发泡期(GV)、减数分裂中期Ⅰ(MⅠ)和中期Ⅱ(MⅡ)阶段食蟹猴卵母细胞的冷冻保存分别获得了87.5%、78.3%和83.3%的存活率，对相同阶段猕猴卵母细胞的冷冻保存分别获得了83.4%、89.2%和76.9%的存活率。本方法采用DMSO和EG为冷冻保护剂，玻璃化程序是先把卵在含有7.5%DMSO和7.5%EG(v/v，以培养液配制)的平衡液内平衡5 min，然后将卵转入含有15% DMSO、15% EG和0.5 mol/L蔗糖的冷冻液内孵育30~60 s，最后将卵装载于开放载体上，并直接迅速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。解冻程序是把开放的卵载体从液氮取出后，直接浸入37℃的含有1 mol/L蔗糖的解冻液内孵育1 min，然后在室温0.5 mol/L蔗糖液内孵育3~4 min进行恢复，最后在室温的培养液内孵育8~10 min。目前在旧大陆非人灵长类动物尚无采用冷冻保存的卵进行体外受精的研究报道。

对旧大陆猴胚胎冷冻保存和胚胎移植的研究最先在狒狒(分裂阶段胚胎和囊胚)和食蟹猴(4~8细胞阶段胚胎)获得成功(Popeet al.,1984,1986;Balmacedaet al.,1986)。狒狒胚胎通过自然交配和非手术性生殖道冲洗法获得，冷冻保护剂为1.4 mol/L甘油，冷冻方法为慢速冷冻，即在甘油冷冻液内进行室温平衡后，将胚胎装载入0.25 mL冷冻麦管内，然后以每分钟2℃的速率从室温逐渐降至-7℃，人工植冰后，再以每分钟0.3℃~0.5℃冷却至-30℃，最后浸入液氮保存。解冻方法是先在20℃水内解冻，然后在含有0.5 mol/L蔗糖和牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)内于室温培养5~10 min进行水化复苏。解冻后存活的8细胞阶段胚胎在被移植到性皮肤开始消肿3 d后的狒狒子宫内后，获得了33.0%怀孕率(Popeet al.,1986)。采用1.5 mol/L DMSO及与狒狒胚胎相似的冷冻和解冻方法，食蟹猴4~8细胞阶段胚胎在冷冻保存和解冻后获得了70.0%的存活率，并且胚胎在移植到同步发情的受体后获得33.3%的怀孕率(Balmacedaet al.,1986)。

冷冻保护剂1,2-丙二醇(1,2-propanediol,PROH)和慢速冷冻法也被成功用于冷冻保存食蟹猴的2~8细胞阶段的胚胎，冷冻保存后胚胎的存活率达82.0%(Curnowet al.,2002)。方法是把胚胎先在含有1.5 mol/L PROH的平衡液内于室温培养10 min，然后转入含有1.5 mol/L PROH和0.1mol/L蔗糖的冷冻液内，并装入冷冻麦管。密封麦管后，把样品在程控冷冻液内降温，使其以每分钟2℃降至-6℃，然后植冰，进而以每分钟0.3℃降至-40℃，最后转入液氮保存。解冻方法是把冷冻麦管从液氮取出后，在空气中停滞10 s，然后在37℃水浴内孵育10 s，接着把胚胎从麦管转入含有1.0 mol/L PROH和0.2 mol/L蔗糖的PBS+BSA内室温培养5 min，然后依次分别在含有0.5 mol/L PROH和0.2 mol/L蔗糖的PBS+BSA内培养5~10 min，达到逐步复水和复苏的目的。

对猕猴和食蟹猴的研究还发现，分裂期的胚胎和囊胚也可以采用玻璃化方法进行冷冻保存。食蟹猴分裂期(4~8细胞阶段)胚胎通过玻璃化保存和解冻后，存活率为95.0%，并且存活的胚胎在经过体外培养和胚胎移植后获得了29.2%的怀孕率，并从7只怀孕母猴获得了3个健康幼仔(Yamasakiet al.,2011)。所采用的胚胎玻璃化的平衡液和冷冻液的配方以及玻璃化步骤与上述猕猴和食蟹猴卵母细胞的玻璃化方法近似(黄璋琼等，2014)，即平衡液为7.5% DMSO+7.5% EG(v/v)，冷冻液为15% DMSO+15% EG+0.5 mol/L蔗糖，冷冻载体为开放的Cryotop聚丙烯条(Yamasakiet al.,2011)。

囊胚由于具有含有大量水分的囊胚腔，在冷冻过程中容易结冰，因此需要在冷冻前进行囊胚腔脱水。囊胚腔脱水可通过机械穿刺或渗透性脱水来完成。在猕猴囊胚的研究发现(Yeomanet al.,2001)，囊胚先后在平衡液A(1.36 mol/L甘油)和平衡液B(1.36 mol/L甘油+2.7 mol/L EG)内于室温平衡3 min，然后在含有3.4 mol/L甘油和4.5 mol/L EG的冷冻液内停留25 s，最后把胚胎装载于开放载体上，并快速、直接地浸入液氮，采用此玻璃化方法冷冻保存的囊胚在解冻后获得了85.0%的成活率和71.0%的孵化率。

3 巨猿类种质冷冻保存

巨猿类动物是最高等非人灵长类，与人类亲缘关系最近，包括长臂猿属(Hylobates)、猩猩(Pongo pygmaeus)、大猩猩(Gorilla gorilla)、黑猩猩(Pan troglodytes)和倭黑猩猩(Pan paniscu)等，主要分布于非洲、南亚和东南亚(Rylands and Mittermeier,2014)。由于本类群动物分布范围小和数量极少，种质冷冻保存研究的报道极其有限，且仅限于精子的冷冻保存。对黑猩猩精子的研究发现，含有7.8%甘油和15%(v/v)热灭活人脐带血清的Ham’s F10培养液是良好的精子冷冻液。精子在此冷冻液内于4℃冷却30 min后，进行程控慢速冷冻，使样品先以每分钟-5℃的冷却速率从4℃缓慢降至-30℃，然后以每分钟-25℃的冷却速率从-30℃快速降至-100℃，最后直接浸入液氮保存。解冻后精子活力恢复率达70.0%，并且采用冷冻保存的精液进行人工授精，成功地使两只雌性黑猩猩怀孕(Gould and Styperek,1989)。

对白掌长臂猿(Hylobates lar)精液的冷冻保存研究发现，TEST+20%鸡蛋黄+5%甘油(v/v)对精液的冷冻保存效果较好，冷冻方法和上述猕猴及食蟹猴精子的冷冻方法近似，即先将精液悬浮在TEST+20%鸡蛋黄内，在2 h内将样品温度由室温逐渐降至4℃，后加入5%甘油，把样品装载入冷冻容器，接着放在液氮面上方5 cm处的液氮蒸汽内快速冷冻10 min，最后浸入液氮保存。冷冻保存的精子在解冻后具有25.0%~35.0%的活力，与新鲜精子60.0%~75.0%的活力相比，恢复率为40.0%~58.0%(Takasuet al.,2016)。

和其他非人灵长类动物一样(除大猩猩外)，巨猿类动物的精液在射精后变成凝胶状固体(Kinoshitaet al.,2021)，因此阻碍精子的制备过程。最近的研究发现，用0.1%(w/v)Ⅰ型胶原酶处理猩猩和黑猩猩的凝固精液后可以将不少精子从中释放出来，并且这种处理不影响精子活力，也不会刺激精子自发地获能和顶体反应，因此，应用Ⅰ型胶原酶处理精液凝块是获得精子的有效方法(Yuet al.,2018)。早期的研究发现蛋白酶处理猕猴、狒狒、黑猩猩等动物的精液凝块虽然有助于获得精子，但蛋白酶处理会损伤精子(Gould and Styperek,1989;Morrell and Hodges,1998)。

4 睾丸组织冷冻保存

最近在年幼猕猴的研究发现，睾丸组织在冷冻保存和自体移植后，移植的睾丸组织具有精子发生的能力，并且产生的精子可以使卵受精和发育成健康后代(Fayomiet al.,2019)，充分表明睾丸组织冷冻保存是保存物种遗传物质和生育力的重要途经之一。对于意外死亡的性成熟雄性非人灵长类动物，可以从附睾中采集精子进行冷冻保存，也可以从睾丸采集精子或早期阶段的生殖细胞(Silvaet al.,2020)。睾丸精子可以在分离后进行冷冻保存，也可以组织碎片的形式进行冷冻保存，并且后者可以一同保存精原干细胞及其增殖和分化所需要的体内微环境，有利于组织移植后生育力的迅速恢复或再生(Baertet al.,2018;Shettyet al.,2018,2020)。睾丸精子细胞可以通过ICSI技术使卵受精，而睾丸组织可以通过组织移植或体外精子发生的方法达到生殖目的(Honaramoozet al.,2004;Hermannet al.,2012)。由于性成熟前雄性动物尚无精子发生，附睾和睾丸内不存在精子细胞，因此只能通过冷冻保存含有精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSC)的睾丸组织才能达到保存遗传物质和种质的目的(Huleihel and Lunenfeld,2020)。

对食蟹猴的研究发现，睾丸组织冷冻保存较细胞悬液的冷冻保存效果好，组织冷冻保存后的细胞存活度为46.0%±4.8%，而细胞悬液冷冻保存后的细胞存活度只有33.7%±6.0%(Junget al.,2020)。细胞悬液冷冻保存虽然可以绕过组织冷冻保存遇到的热量和质量交换障碍，然而，细胞悬液的获得一般需要进行酶处理、机械分离和离心等，这均可能造成细胞损伤，影响后续的冷冻保存和复苏效果(Schneideret al.,2015)。

研究发现，睾丸组织冷冻保存的方法以慢速冷冻较好，已经应用的冷冻保护剂包括DMSO、EG、甘油、蔗糖和海藻糖等。对猕猴的研究发现，性成熟前幼猴睾丸组织碎片在含有1.4 mol/L DMSO或EG的冷冻液内被成功进行慢速冷冻保存，解冻的睾丸组织被移植到免疫缺陷型小鼠皮下后，可发生组织增生和细胞分化，形成生殖细胞(Jahnukainenet al.,2007)。研究还发现，慢速冷冻保存的性成熟前幼猴睾丸组织碎片在通过自体移植方法移植到去势的性成熟猕猴背部或阴囊皮下后，移植的睾丸组织细胞能够迅速生长和分化、再生睾酮分泌和精子发生功能(Fayomiet al.,2019)。慢速冷冻采用的冷冻液为含有5% DMSO和5%胎牛血清(v/v)的MEMα培养液，样品先在4℃平衡30 min，然后在程控冷冻仪内以每分钟-1℃的冷却速率从4℃降至0℃，接着以每分钟-0.5℃从0℃降至-8℃，在此温度下进行人工植冰，然后以每分钟-0.5℃降至-40℃，接着以每分钟-1.5℃从-40℃降至-80℃，最后快速浸入和保存于液氮内(Fayomiet al.,2019)。最近对青春期前食蟹猴睾丸组织的慢速冷冻研究发现，含有1.4 mol/L DMSO和0.2 mol/L海藻糖的冷冻液比只含有1.5 mol/L DMSO的冷冻液的冷冻保存效果好，前者冷冻保存和解冻后培养的睾丸组织内生殖细胞的细胞数量为(2.4±0.6)×106/g，而后者冷冻保存和解冻后培养的睾丸组织内生殖细胞的数量只有(1.1±0.3)×106/g(Junget al.,2020)。

以10%~20%(v/v)DMSO为冷冻保护剂，慢速冷冻法还被用于山魈(Mandrillus sphinx)、黑猩猩和白头狨猴(Callithrix geoffroyi)的睾丸组织冷冻保存，发现这3种动物性成熟的睾丸组织在冷冻保存和解冻后，均能表达精子细胞特有的PRM2和TNP1蛋白质(Pothanaet al.,2016)。睾丸组织冷冻保存的另外一个方法是玻璃化。早期对猕猴的研究发现，玻璃化方法可对幼猴睾丸组织的结构以及精母细胞和支持细胞(Sertoli细胞和Leydig细胞)的结构和功能进行有效地冷冻保存(Poelset al.,2012)，但是如上所述，近年来对非人灵长类动物睾丸组织冷冻保存的研究主要采用的是慢速冷冻方法，另外在人类中获得的不少研究结果也显示慢速冷冻较玻璃化能更好地保存睾丸组织的结构和功能(Moravejiet al.,2019)。

5 卵巢组织冷冻保存

卵巢组织冷冻保存已经在人类、非人灵长类和其他哺乳动物类群中证明是行之有效的保存遗传物质和生育力的方法(Dolmanset al.,2021;Bhat and Sofi,2021)，并且对青春期前雌性和需要立即进行化疗的成年妇女癌症患者来说，卵巢组织冷冻保存是生育力保存的唯一方法(Leeet al.,2004,2017;Devi and Goel,2016;Ladanyiet al.,2017;Pampaniniet al.,2020)。冷冻保存的卵巢组织将来可以通过自体移植恢复生育能力，也可以通过卵泡体外激活(IVA)或卵母细胞体外成熟(IVM)等方法在体外生产卵子，达到生殖目的。卵巢组织冷冻保存的策略主要集中在对卵巢皮质内众多原始卵泡的原位保存，这样使原始卵母细胞及其周围细胞和组织构成的微环境一并得到冷冻保存。与成熟的卵母细胞相比，原始卵母细胞在体积上小3~4倍，更适合冷冻保存(Dolmanset al.,2021)。一些研究还认为小鼠、食蟹猴和人类等卵巢内存在雌性生殖干细胞或卵原干细胞(Oogonial stem cells)，但目前对其是否存在仍具有争议(Whiteet al.,2012;Wagneret al.,2020;Liet al.,2022)。

和人类卵巢组织的冷冻保存方法一样(Ladanyiet al.,2017;Kometaset al.,2021)，非人灵长类动物卵巢组织冷冻保存的有效方法是玻璃化方法，包括快速冷冻和超快速冷冻。对成年猕猴卵巢皮层组织的快速冷冻研究发现，冷冻液VEG(27% EG+27%甘油，w/v)对原始卵泡和初级卵泡形态和功能的冷冻保存效果较冷冻液VED(25.5% EG+25.5% DMSO，w/v)好，且用VEG冷冻保存的卵巢组织在体外3D培养6周后能与新鲜卵巢组织一样存活、生长和分泌雌二醇与孕酮(Tinget al.,2013)。对成年狒狒卵巢组织的玻璃化研究发现，卵巢组织在26%(w/v)EG和1 mol/L蔗糖的存在下可在较低浓度DMSO(10%,w/v)的冷冻液内进行有效的玻璃化冷冻，冷冻保存的卵巢组织在自体移植后可恢复卵泡的生存、生长和内分泌功能(Amorimet al.,2013,2019)。采用同样的冷冻液和玻璃化方法，食蟹猴卵巢组织也得到了良好的保存(Dolmanset al.,2015)。在膜非通透性冷冻保护剂蔗糖或海藻糖的存在下，采用较低浓度的膜通透性冷冻保护剂进行玻璃化保存，有利于降低冷冻液的细胞毒性。

对食蟹猴的研究发现，卵巢组织在玻璃化保存后进行自体移植，卵巢的功能可以得以恢复(Suzukiet al.,2012)。该研究采用含有20%血清替代品补充剂(Serum Substitute Supplement,SSS)、5.64 mol/L EG、5%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量360 kDa)和0.5 mol/L蔗糖的H199培养液做为冷冻液。卵巢皮层碎片尺寸为1 mm×1 mm×1 mm，在玻璃化冷冻前分三步在室温进行平衡，即先在含20%SSS和1.61 mol/L EG的平衡液内孵育10 min，进而在含有20% SSS和3.22 mol/L EG的平衡液内孵育10 min，然后在冷冻液内平衡5 min。把样品装入0.5 mL冷冻麦管内并密封后，直接浸入液氮冷冻保存。解冻在35℃~37℃下进行，并分别在含有0.8 mol/L、0.4 mol/L和0.0 mol/L蔗糖的H99培养液内逐步进行复水和复苏。

对新生普通狨猴卵巢玻璃化冷冻保存的初步研究发现，常用的人类卵玻璃化冷冻方法也可以有效地冷冻保存卵巢组织内的卵母细胞(Motohashi and Ishibashi,2016)。具体方法是把幼小的卵巢(长轴2.8 mm±0.1 mm，短轴1.2 mm±0.1 mm)清洗后，先在含有7.5% EG、7.5% DMSO和20%SSS的HEPES-TCM199培养液内室温孵育15 min，然后在含有15% EG、15% DMSO和0.5 mol/L蔗糖的HEPES-TCM199培养液内于4℃孵育30 min，最后装载到Cryotop上直接浸入液氮进行冷冻保存。解冻方法是把Cryotop从液氮中取出后，快速浸入37℃的含有1 mol/L蔗糖的HEPES-TCM199培养液内孵育10 min。

6 总结和展望

原猴动物主要分布于非洲和亚洲南部热带地区，包括各种狐猴、懒猴、婴猴科(Galagidae)和眼镜猴等类群，约150种，其中狐猴亚目全部90多种仅分布在马达加斯加岛及其附近小岛(Rylands and Mittermeier,2014；中国野生动物保护协会，2020)。虽然不少原猴动物处于濒危状态(Aslamet al.,2002;Chatfieldet al.,2007)，但目前对这些非人灵长类动物种质保存和辅助生殖的研究基本仍属空白。

野生巨猿类是最濒危的非人灵长类动物，但由于其生存高度依赖森林环境、分布范围狭小和数量极少，对其种质冷冻保存的研究极其有限。由于巨猿类动物与人类亲缘关系最近，因此人类精子、卵子、胚胎和性腺组织冷冻保存的研究成果应该对巨猿类最具有借鉴意义。现在的关键是需要进一步重视种质的保存，建立冷冻保存实验室和保存设施，并配备熟练掌握种质冷冻保存的科技人员进行生殖材料的冷冻保存。特别是要建立精液采集和冷冻保存的方法和技术条件，并注意从死亡动物的附睾中获得和冷冻保存精子。另外，还要及时采集死亡动物的睾丸和卵巢，并对之进行冷冻保存。

迄今为止，对非人灵长类动物种质冷冻保存的研究主要集中于旧大陆猴的猕猴、食蟹猴和狒狒以及新大陆猴的狨猴、松鼠猴和卷尾猴等，而且主要限于精子和生殖腺组织的冷冻保存，对成熟卵母细胞冷冻保存的研究很少。精子冷冻保存长期以来一直是遗传资源和生育力保存及辅助生殖的重要策略，尽管在非人灵长类精子冷冻保存方面取得了广泛进展，但目前尚未被广泛用于促进非人灵长类动物的种群繁殖和对遗传资源多样性的长期保存，重要原因是冷冻保存后精子活力仍然显著下降，特别是狨猴和松鼠猴精子的冷冻保存效果最差(Oliveiraet al.,2015,2016;Arakakiet al.,2019a)，因此需要进一步研究不同类群非人灵长类动物精子的生殖生物学和冷冻生物学特性，改进冷冻方法和提高冷冻保存的效率。

冷冻保存需要克服的主要困难是细胞和组织对低温损伤的脆弱性，这取决于细胞或组织的大小和种类、细胞膜的结构组成及对水和冷冻保护剂的渗透性、细胞对渗透压和温度变化速率的耐受性，以及冷冻保护剂的细胞毒性等。高浓度的通透性低温保护剂具有一定的细胞毒性，并且毒性大小与其浓度、暴露时间和温度呈正相关(Pegg,2015;Fahy and Wowk,2021)。低温保存过程的不同阶段对细胞会造成多种不利影响或伤害，如冷休克、渗透性休克、结冰、溶液效应和氧化应激等。活化氧是细胞呼吸的产物，如O2-、H2O2和OH-等，正常情况下产生的活化氧是细胞功能所需要的，但在逆境条件下细胞可产生和积累过量的活化氧，因而造成细胞结构和机能的损伤。大量对人类、啮齿类和其他哺乳动物的研究已经证明，精子的低温保存过程伴随着线粒体损伤、抗氧化系统的破坏和活化氧的积累，因此氧化损伤是导致精子低温损伤的重要原因之一(Chatterjee and Gagnon,2001;Thomsonet al.,2009;Gadeaet al.,2011)。猕猴精子冷冻可导致活化氧浓度的显著升高(McCarthy and Meyers,2011)，因此在冷冻液中添加抗氧化剂如维生素E等有益于精子活力的冷冻保护，特别是对质量较差和对冷冻损伤敏感的精子样品的冷冻保护作用更加明显(Donget al.,2010)，但是迄今为止对抗氧化剂在非人灵长类动物精子冷冻保存过程中的保护作用的研究很少，需要进一步探索不同种类和剂量的抗氧化剂对不同非人灵长类动物精子的冷冻保护作用，并借鉴在人类和其他哺乳动物中已经获得的有关抗氧化剂冷冻保护精子的研究成果(Liet al.,2014;Karimfaret al.,2015;Amidiet al.,2016;Shiet al.,2018)。

除了精子活力、存活度和顶体结构等的保护外，冷冻保存还必须高度重视对精子遗传物质的保护。对猕猴、人类和小鼠等的研究显示，目前的精子冷冻保存技术可以使一些精子的DNA受到损伤，进而造成胚胎发育率低、着床失败、流产或使后代的健康受到影响(Liet al.,2007;Ziniet al.,2008;Cankutet al.,2019;Li and Lloyd,2020)。对小鼠和人类的研究还发现，精液或附睾中精子的数量、形态和活力与精子DNA损伤程度呈高度直线负相关(Li and Lloyd,2020)，且质量差的精子的DNA更容易在冷冻保存过程中受到损伤(Lopeset al.,2021)。

虽然精子保存是种质保存最方便和最有效的方法，卵子和胚胎的冷冻保存也是重要的遗传物质和生育力保存的方法，对物种保护、保存和辅助生殖必不可少。目前虽然非人灵长类动物胚胎的冷冻保存方法已经成熟，但对非人灵长类动物卵的冷冻保存的研究尚处于起步阶段，不过人类卵冷冻保存的研究成果可以做为借鉴。人类卵母细胞低温生物学和冷冻保存的研究始于20世纪70年代，现在已经在不育症治疗和生育力保存方面得到广泛应用。人卵冷冻保存常用的方法是玻璃化超快速冷冻，冷冻保护剂包括DMSO、EG、蔗糖和海藻糖(Kuwayamaet al.,2005;Moussaet al.,2014;Picton,2018;Bhat and Sofi,2021)。目前人卵冷冻保存的最大问题是冷冻保存过程本身导致的透明带提早硬化(premature zona hardening)，从而阻止精子穿过透明带，因此卵在冷冻保存和解冻复苏后无法用常规的体外受精方法使其高效受精，不得不借助ICSI达到受精的目的(Moussaet al.,2014；石晓卫等，2019)，因此需要深入研究卵在冷冻保存过程中透明带提前硬化的机制和防御对策。

动物的多样性决定了各类群和各物种生殖生物学、生理学和冷冻生物学的多样性(Hildebrandtet al.,2021)，因此，为了更好地开展非人灵长类动物种质保存工作，亟需加强对各种非人灵长类动物生殖生物学、生理学和生殖材料冷冻生物学的基础研究(Bhat and Sofi,2021)。只有了解了各种动物的生殖季节性规律，才能在最佳的季节和时间采集冷冻保存所需要的高质量精子、卵子、胚胎和生殖腺组织。只有在了解各种动物发情规律和排卵周期的情况下才能建立刺激卵泡发育和达到超数排卵的最佳效果。另外，只有在分别建立了各种动物精子、卵子和胚胎理想的体外培养条件和方法的情况下，才能将获得的珍贵材料进行科学有效的处理和培养，进而达到冷冻保存高质量种质的目的。此外，了解和建立各种动物精子获能和体外受精(IVF)的条件和方法后，才能有效地进行IVF或ICSI，生产冷冻保存所需要的胚胎。当然，非人灵长类动物种质保存、辅助受精和生殖生物学的研究和应用还需要更多的科技人员和经费的投入。