鸭病毒性肠炎的研究进展

陈玉珍 永安市动物疫病预防控制中心 福建永安 366000

鸭病毒性肠炎（DVE）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性发热性传染病，通过接触传播，与败血症相关，以血管损伤、组织出血、消化道黏膜损伤和肠黏膜病变为特征。传播迅速，发病率和病死率都很高[1]。全球DP于1923年在荷兰首次暴发。随后DP于1973年在南达科他州暴发，43 000羽鸭和鹅陆续发病、死亡，流行病学调查表明野生鸟类和农场家禽不仅携带相同DPV，且病毒学和血清学均为阳性，荷兰和南达科他州DP的暴发并不是该区域所特有，在世界范围内皆有发生，如英国、印度和加拿大等[2]。1957年我国首次DP发生于广东省，之后武汉、上海、浙江、江苏、广西、湖南和福建等地陆续发现，至20世纪80年代传播到东北各省[3]。值得注意的是，除鹅和鸭外，自由放养的水禽也是DPV感染携带者，之前的研究对132个野外分离株的分析中发现，在96羽禽类中存在DPV（72.7%），包括野鸭（Anas platyrhynchos）、疣鼻天鹅（Cygnus olor）、灰背雁（Anser anser）、苔 原 豆 雁（Anser fabalis）和 灰 鹭（Ardea cinerea）[4]。随着传染源不断扩增，对DP的防治显得尤为重要。

1 DPV基因组结构和分子生物学研究

1.1 DPV基因组结构DVE的病原是DPV或Anatid herpesvirus-1。根据国际病毒分类委员会（ICTV）最近的分类，DPV被分类为Mardivirus属，与HSV-1（单纯疱疹病毒1型）同属于疱疹病毒科的a-疱疹亚科[5]。DPV有囊膜，遗传物质为双股DNA，呈对称的二十面体，具有典型a-疱疹病毒的特征。病毒基因组大小为158～162 kb，由一个唯一的长独特区（UL）、一个唯一的短独特区（US）和两个倒置重复序列（IRS和TRS）[6]组成。共有78个ORF编码潜在的功能蛋白，在这些ORF中，由10个和68个ORF分别编码结构蛋白和非结构蛋白。相对于疱疹病毒科其他成员来说，DNA复制的持续时间长是DPV的特征之一，说明它们在宿主细胞内持续性繁殖。疱疹病毒通过病毒体糖蛋白尖峰附着在宿主细胞受体上，DPV进入宿主细胞内时，会涉及多种糖蛋白[7]。结合后，包膜与宿主细胞的质膜融合，核衣壳进入宿主细胞的细胞质。DNA和蛋白质复合物从核衣壳中分离出来，进入细胞核。然后它会迅速关闭宿主细胞的大分子合成。逐步开始感染，DPV基因组开始三个阶段依次表达，即：即刻早期（IE）、早期和晚期。与DPV同属的HSV-1的即可早期转录是由反式作用因子VP16介导的，与即早（IE，α）基因启动子上游的特定顺式作用元件结合，促进IE基因的转录，即α-TIF。近期发现其同源物pUL48被确定为DPV的α-TIF。并且pUL46和pUL47显著促进pUL48的转录激活，从而增强pUL48的转录激活功能，协同促进病毒基因表达[8]。之后IE基因在感染时立即转录。早期基因在病毒DNA复制之前以IE蛋白依赖的方式转录，晚期基因的转录始于DNA和病毒蛋白的合成开始后。病毒DNA的复制发生在细胞核中，新合成的DNA盘绕成预先形成的未成熟衣壳。病毒粒子DNA的成熟是通过核衣壳和核包膜内层的衣壳化发生。随后，病毒粒子通过核膜出芽而完全包裹。成熟后，病毒粒子在宿主细胞的细胞质内积聚，并通过细胞溶解或胞吐作用释放[9]。

1.2 DPV分子生物学研究 对DPV的研究相对缓慢，与疱疹病毒科其他成员的研究仍有较大差距。Plummer等[10]用HindⅢ消化DPV，得到一个约1.95 kb的DNA片段，发现该片段与水痘带状疱疹病毒UL6和UL7基因部分同源。随后，郭霄峰等[11]发现鸭瘟病毒北京株的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守。随着技术的发展，多个DPV基因已被成功克隆并进行序列分析：张馨月等[12]通过对鸭瘟强弱毒株TK基因及相邻UL24基因进行克隆、测序及分析，发现鸭瘟病毒强毒株和弱毒株TK基因和UL24基因5′端982 bp核苷酸序列均完全一致，与其他鸭瘟病毒毒株的同源性达99.4%以上，表明鸭瘟病毒TK基因高度保守，研究结果为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础，同时也为建立重组DP活载体疫苗创造了条件。程安春等[13]应用鸟枪法成功构建了DPV基因文库，获得大于100 bp的ORF共187个，并初步克隆和鉴定DPV的核衣壳蛋白基因。罗丹丹等[14]利用靶基因步移PCR法获得DPV部分基因的完整ORF，研究结果均指向DPV UL47、UL28应归类为a-疱疹病毒亚科的禽类疱疹病毒科。李玉峰等[15]分别用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI 5种限制性内切酶消化鸭瘟病毒基因组DNA，获得5个UL片段基因，分别为UL33、UL34、UL45、UL46和UL47，经比较发现它们与α-亚科疱疹病毒其他成员相应基因具有不同程度的同源性。随着对DPV基因组的深入研究，对其所发挥的功能也逐渐完善。张树栋[16]利用原核表达系统表达了DPV gB抗原优势区（N端111-190aa），该重组蛋白质具有抗原性，可作为DVE抗体检测的候选抗原；同时制备了相应的兔源多克隆抗体。蔺萌[17]发现DPV gN基因288 bp具有特异性，可以作为区别DPV与其他病毒的特异基因，同时建立了基于DPV gN基因的PCR扩增检测方法，并应用于DVE的临床诊断（最低可以检测到0.1 ng/μL）。崔立虹等[18]在对DPV-gC糖蛋白胞外区的优势抗原表位、对DPV-gC基因进行分段克隆并构建重组表达载体，发现DPV-gC糖蛋白优势抗原表位为第73～88位氨基酸，为DPV-gC糖蛋白具体功能区的研究、诊断试剂及表位疫苗的研制奠定了基础。

2 DPV的流行现状

鸭瘟于1923年在荷兰首次被发现，随后，DP在世界范围内广泛流行。DPV可感染所有年龄段家鸭，发病率和病死率在5%～100%。DP的潜伏期为3～8 d，家鸭在感染后的临床症状为抑郁、共济失调、呼吸困难、眼睑肿胀、头颈部肿胀、腹泻、粪便白绿色、泄殖腔黏膜水肿、绿色假膜覆盖物等。病理组织样本发现患鸭头部和颈部肿胀的皮肤中观察到淡黄色透明液体，免疫器官有出血点、坏死灶和溃疡，脑部有血管套等典型特征[19]。DPV传播能力广泛，可通过直接和间接途径传播，家鸭与野生水禽在传播DPV上具有双向性[20]。由于水禽生存在水生环境中，因此DPV主要通过水传播；大多数家鸭的DP暴发区域，通常是在野生水禽的开放水域附近，患鸭感染后可经粪便和口分泌物长期排毒[21]，从而使得整个环境受到DPV污染，且DPV难以彻底消灭。威斯康星州一处鸭场暴发DP四年后，对该鸭场的家鸭泄殖腔拭子进行检测，仍然可以检测到DPV[22]。不仅如此，自由飞行的鸟类也是DPV的传播途径之一，据调查，当H5N1亚型禽流感病毒向西部传播时，鸟类在疫情暴发期间，死亡率14%～81%，成年鸟类死亡率较高，随即对当地的水禽进行鸭瘟病毒测试，发现鸭和鹅的器官均分离出疱疹病毒，并被确定为DPV[22]。鸭、鹅康复后，DPV可潜伏在三叉神经节、外周血淋巴细胞和淋巴组织中，可携带DPV长达4年，充分说明DP潜伏期持续时间长，难以根除该病的发生。近几年，DP在我国各地起伏性发生，通过长期监测该病一年四季均可发生，尤其在春秋两季多发，说明DP还可通过其他途径传播感染。此外，空气传播和垂直传播也是该病的主要传播方式[23]。

3 DPV与宿主天然免疫应答

先天性免疫是以天然免疫的方式抵抗外来病毒的入侵。可非特异性对病原的识别受体（PRR）诱导产生I型干扰素（IFN）和炎性细胞因子，使机体在发育过程中逐渐形成一系列的防御体系。其中，PRR包括Toll样受体（TLR）、NOD样受体（NLR）和RIGI样受体（RLR）等。不同位置PRR所发挥的功能不同，TLR是跨膜蛋白I家族的成员，位于细胞表面和内膜中，负责识别配体；NLRs是PRR家族另一组受体，位于细胞质中，识别直接入侵或者间接进入细胞内的病原。RLRs大多位于体内的细胞质中，也有研究表明RLR可能位于细胞核，负责识别机体内引起的绝大多数病毒感染[24]。在鸭中发现的TLRs，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR15。体内试验表明，DPV感染1 d后，TLR2在大脑中增加了132.6倍，TLR21在脾脏增加100倍以上，激活的TLR21和TLR2募集接头蛋白，分别诱导MyD88在脑和脾中表达量升高，激发下游信号通路，产生Ⅰ型干扰素，抵御DPV感染。此外，TLR21在调节宿主对外来入侵的防御起重要作用，是哺乳动物TLR9的功能同源物[25]。TLR21可以识别未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG-ODN），并激活NF-κB免疫信号通路。而TLR9在小鼠中也可以通过由单个CpG基序组成的CpG-ODN激活。综上所述TLR9和TLR21均在DPV感染的宿主防御中发挥重要作用。RLR家族的3个成员RIG-I、MDA5和LGP2在大多数组织中表达，当DPV感染鸭胚成纤维细胞（DEF）时，DPV感染持续时间和细胞内病毒DNA不断增加，与此同时，IFN-β和RIG-I也不断上调，体内和体外都激活IFN-β和RIG-I[26]。RIG-I抑制了DPV感染，同时在MDA5过度表达的DEF细胞中，DPV感染被显著抑制，而siRNA对MDA5的击倒显著增强了DPV的生长。DPV感染后，MDA5的转录水平在体内和体外都受到上调。在抗病毒信号传导方面，MDA5与LGP2之间存在联系，LGP2在MDA5特异性增强和干扰之间充当浓度依赖开关。这些结果表明，MDA5限制了DPV复制，LGP2在MDA5介导的抗DPV活性中起着关键作用[27]。以上研究发现，RIG-1、MDA5和LGP2参与了宿主对DPV的天然免疫应答。MAVS的过度表达显著降低DPV的复制，敲除MAVS，则IFN-β、OAS和IL-2下调，表明MAVS显著降低调节细胞因子的激活[28]，除了TLR和RLR外，其他PRRS在应对微生物感染方面也起着至关重要的作用。

4 DP的诊断与防控

病毒分离与鉴定是诊断病毒性疾病的核心标准，通常采取患鸭血液、肝、脾或肾作为分离病毒的样品，经研磨、离心、过滤后接种到鸡胚或鸭胚，或者CEF、MDEF、DEF细胞系中进行培 养。其中，DEF细胞对鸭病毒性肠炎疫苗株分离率最高[29]。强毒性DPV会产生明显的细胞病变，通过电镜超薄切片检查细胞培养物，发现接种病毒12 h后，在细胞浆内可观察到带囊膜的成熟病毒粒子，且染色检查发现大量核内包涵体[30]。随着分子生物学技术的发展，已开发出大量的病原学（ISH、PCR、LAMP和PCRDHPLC技术等）和血清学（HCT、IFA、ELISA、GICA等）检测方法，其中PCR技术是广泛应用的病原检测方法，适用于流行病学调查和临床诊断。近几年，常结合多种方法检测DPV，如从DPV基因组中根据不同目的选择基因片段，采用原核表达技术获得重组蛋白并制备相应抗体，再利用IFA或HCT技术检测组织中的DPV[31]，随着诊断方法不断完善，鸭瘟也将会得到更好控制。由多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱和鸭瘟病毒引起的鸭瘟，已被认识和研究多年，但仍然是影响鸭的重要疾病。对此，疫苗接种是预防和控制DP的主要手段，疫苗分为灭活苗和弱毒苗两大类，通常国内使用弱毒苗对鸭群进行免疫接种。但潜伏期和间歇性排毒是弱毒苗使用中最重要的制约因素之一，完全避免病毒基因组DNA是解决该问题的唯一可能方法。病毒载体疫苗的优势，是能够区分受感染与接种疫苗的宿主[32]。gD DNA和蛋白质组合的小鼠模型中对DPV攻击感染后产生中和抗体，诱导了淋巴细胞增殖反应及IL-4、IL-12和IFN-g产生，为DP的低疫苗接种率和减少鸭DP暴发提供了很好的解决方案。另外，含有多发性巴氏杆菌菌株X-73重组外膜蛋白H（rOmpH）和鸭瘟减毒活疫苗的组合疫苗，不仅不会影响鸭群的抗体反应，同时保护鸭群免受实验性多球菌感染[33]。但应防止细菌或病毒基因组不稳定，导致难以产生重组病毒。通过NHEJ/CRISPR-Cas9系统对DPV基因组进行编辑，以在UL55-LORF11和UL44/44.5中包含和表达特定的细菌抗原ompH-V5基因插入且稳定该基因，不仅保护鸭免受病毒和细菌的侵害，还有一定的预防其他疾病的防护作用，有助于控制和防止鸭发生病毒与细菌共感染[34]。对于开发DPV载体重组疫苗，需要进一步进行动物试验，以评估该重组疫苗的功效和保护作用。

5 展 望

长期以来，疱疹病毒感染和潜伏期一直是防控DPV感染最重要的问题，随着DP疫苗的上市，病毒传染源和传播途径得到有力控制。但在全国范围内DPV出现零星性流行并伴随发生基因组变异，对DPV毒株全基因组测序分析发现，临床上出现多株新的变异毒株。重组DNA会成为DP疫苗研究的新技术，但对变异毒株是否具有免疫保护力，还需要进一步研究。此外，DPV的潜在宿主可能是长期病毒携带者，容易将感染延续到环境中，彻底去除传染源也是要攻克的难题，同时潜伏感染与细胞凋亡之间是否存在关联也需要进一步研究。