新城疫流行病学与新型疫苗研究进展

曾建平 惠安县净峰镇畜牧兽医站 福建惠安 362142

1 新城疫简述

新城疫（Newcastle disease，ND）的病原是副黏病毒科新城疫样病毒属（Avulavirus）的禽副黏病毒I型（APMV-1），是在全球野生以及家养禽类中很严重的传染性疫病，特别是对鸡发病率高、病死率高，给养鸡场带来严重的经济损失。尽管采用了广泛的疫苗接种防范方法，ND仍然对全球家禽业构成巨大威胁。并且ND被OIE列为必须通报的动物疾病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病，是《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》确定的优先防治病种及种禽场净化病种之一[1-3]。

2 新城疫病毒的特征

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是近似球形的病毒粒子，直径一般为100～400 nm。病毒囊膜表面覆盖有纤突，包膜为双层结构膜，是由宿主细胞的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来的。NDV为单股负链RNA病毒，可编码6种病毒特异性结构蛋白，依次为3′-Leader-NP-P-M-F-HN-L-5′，全长约为15 kb[4]，其中F蛋白与NDV的致病性密切相关，是实验室进行该病毒遗传变异分析及分子流行病学调查的一个重要依据。就禽而言，NDV侵染后，会导致胸腺和法氏囊淋巴细胞出现凋亡和死亡，从而淋巴细胞缺失，抑制了体液免疫和细胞免疫。研究发现，NDV对法氏囊的破坏会导致B细胞丧失产生IgG的能力，从而引起免疫抑制[5-7]。同时，NDV会与其他免疫抑制性病毒共感染，从而引起严重的免疫抑制，造成免疫水平低下，抗体水平不高，进而给养殖业带来重大损失。

3 新城疫流行病学

新城疫已在全球范围内暴发，主要集中在亚洲许多国家以及中东和非洲等[8]。新城疫于1926年在印度尼西亚爪哇岛首次被发现[9]，而我国是在1946年首次检测到新城疫病毒[2]，主要是由于从国外引进新品种鸡时传入的。目前该病己呈世界性分布[10]，近20年持续发展，宿主范围仍在不断扩大，几乎蔓延到所有的禽类和鸟类，如鸽、鹌鹑、鸵鸟、鸡、鸭、鹅等，甚至在部分较为原始的农村散养户也可分离到NDV[11-14]。

新城疫是由禽副黏病毒I型（APMV-1）引起的，APMV-1病毒株可分成两类（I类和II类），并进一步分类为基于遗传差异的基因型。I类病毒通常存在于野生水禽中，并且具有低毒力；II类病毒在遗传和表型上更多样化，并且具有更广泛的毒力[15]。II类病毒最初分为15种基因型，然而，自2012年以来又增加了4种基因型[16-18]。基因型II、III、IV、V的病毒导致了20世纪20年代至60年代的第一次及第二次人畜共患病。来自基因型III、IV、Ⅸ和Ⅹ的病毒与基因型Ⅰ和基因型Ⅱ的病毒相关，但只在世界有限的地区传播。基因型V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和XI出现于20世纪60年代之后，被认为是“晚期”基因型[19]。目前，来自基因型VII的病毒尤其令人担忧，因为一些病毒在接种疫苗的家禽中表现出较高的死亡率。20世纪80～90年代分离到的NDV毒株则以基因型VII为主，这也是在我国首次分离到的VII型新城疫病毒，至今仍然是在我国禽类中流行的优势基因型[20]。基因型XIV包含2006-2008年在西非和中非分离获得的剧毒vNDV。基因型XV[17]是从中国的鸡和鹅中分离获得的毒株。有证据表明，自1926年发现第一个vNDV以来，来自多种基因型的vNDV毒株在不同地点和不同宿主中同时进化一直在继续[15]。

近几年有较多学者发现越来越多临床案例都呈现非典型性感染，且常与其他病毒或细菌呈现共感染，如与大肠杆菌[21]、鸡传染性贫血病毒（CIAV）[22]、马立克氏病病毒（MDV）[23]、传染性法氏囊病病毒（IBDV）共感染[24]等，从研究结果来看，NDV在鸡群中仍广泛存在，对养殖业的危害是非常严重的。

4 新城疫诊断技术

近年来，新城疫已不再表现典型的临床症状，仅凭患鸡的临床症状很难作出准确的判断。所以，应借助实验室诊断技术来进行确诊，如通过病毒分离和鉴定、ELISA试验、免疫荧光、琼脂双扩散试验、神经氨酸酶抑制试验及血清学诊断等方法来判定。然而，这些方法通常速度较慢，需要配备有生物安全防护设施的专业实验室。在发展中国家，ND诊断中最常用的分子检测法是RT-PCR，具有较高的灵敏度。qPCR检测通常被用于直接从临床样本中进行NDV筛查和病理分型的标准方法[25-26]。Pham等[27]开发了一种基于LAMP的检测方法，用于直接从临床样本中检测NDV，它操作更简单且成本低廉。微阵列杂交技术、生物传感器诊断及高通量测序技术等尖端技术的出现，可以同时监测、检测和表征数百至数千个目标，而不会影响检测的灵敏度和特异性[28-29]。

5 新型疫苗

尽管现有疫苗对任何NDV毒株感染可在一定程度上有减轻临床症状、降低病死率的保护作用，但免疫疫苗后并不能阻止强毒株的散播，这使得NDV强毒株持续存在。因此，必须极其谨慎地使用减毒活疫苗，需要最先进的疫苗来解决这些弱点。

5.1 疫苗种类

5.1.1 DNA疫苗 当DNA疫苗中的重组质粒被应用到动物宿主中时，克隆的基因进行转录和翻译成蛋白质，该蛋白质能够诱导宿主产生保护性免疫反应。研究证明，用壳聚糖包裹的编码NDV F基因的DNA疫苗对SPF鸡进行免疫，鸡的黏膜、体液和细胞介导的反应增强[30]。因此，DNA疫苗是应对当前新城疫挑战的安全替代平台，该类疫苗的主要优点是其安全性高及诱导CD4+和CD8+免疫反应的能力。但是DNA疫苗也有其缺点，包括免疫原性差、生产成本高和不适合大规模给药等，更重要的是，DNA疫苗在没有任何递送载体的情况下给药时，很容易被核酸酶降解。

5.1.2 重组病毒载体疫苗 用于对抗兽医和医学上重要病原体最有希望的策略之一是使用重组病毒载体疫苗。家禽中最常见的载体是痘苗病毒、鸡痘病毒和火鸡疱疹病毒[31-32]，它们具有高度免疫原性，能够通过TLR激活诱导强炎症性先天免疫反应，并且可以更容易地用鸡胚成纤维细胞大规模繁殖。因此，它们经常被用作对抗癌症和许多其他传染病的基因递送工具。然而，该类载体也有局限性，对该载体已有免疫敏感性时不适用。

5.1.3 病毒样颗粒疫苗（VLPs）VLPs在形态上与病毒非常相似，能够引发强大的免疫反应，这使它们成为高度安全的疫苗平台。但是，大批量生产VLPs仍是现有的难题。此外，由于VLPs不能在接种疫苗的宿主中复制，在免疫时需要大量的VLPs与佐剂一起给药，以达到免疫效果[33]。尽管面临许多挑战，VLPs仍然是控制NDV最有希望的安全疫苗平台。

5.2 新城疫病毒作为疫苗载体应用 利用反向遗传学系统对新城疫病毒基因组进行操作，不仅可以研究新城疫病毒的分子生物学和致病机理，还可以开发新城疫病毒作为人和动物疾病的疫苗载体。新城疫病毒载体与其他复制型病毒载体相比有几个优点，新城疫病毒只编码7种蛋白质，载体蛋白与表达的外源抗原之间的免疫反应竞争较小；新城疫病毒在细胞质中复制，不会持续感染；新城疫病毒具有便于基因操作的模块化基因组；新城疫病毒通过鼻腔途径感染，可诱导黏膜和全身免疫反应；最后，由于NDV毒株种类繁多，可作为疫苗载体，新城疫病毒载体疫苗也可用作区分“感染动物和接种疫苗的动物”（DIVA）疫苗。

作为二价疫苗，NDV毒株LaSota首次用于表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）的宿主保护性免疫原VP2蛋白[34]，通过用高毒力的NDV毒株德州GB或强毒力的IBDV变异毒株攻击接种的鸡来评估，免疫诱导针对NDV和IBDV的更高水平的抗体反应，并提供针对这两种病毒的完全保护。结果表明，重组NDV可用作其他禽类病原体的疫苗载体。

NDV作为疫苗载体用于人类的潜力，首先是在非人灵长类动物中确定的。研究发现，通过插入人类副流感病毒3型（HPIV3）的HN蛋白作为保护性抗原，并在非人灵长类动物中评估两个NDV株LaSota和BC作为疫苗载体[35]，是首次证明NDV载体疫苗在非人灵长类动物中有效性的研究。

Nakaya等[36]研究发现重组NDV毒株B1作为人类有效疫苗载体的潜力。体外生长动力学和鸡胚致病性试验表明重组NDV减毒。此外，通过静脉途径免疫的小鼠完全不受致命剂量流感病毒的影响，表明NDV可能是一种安全有效的疫苗载体，可用于哺乳动物和鸟类物种。

NDV被评估为严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARS-CoV）的疫苗载体[37]，该研究构建了两种NDV载体即介晶毒株BC（NDV-BC）和慢基因毒株LaSota，其中F蛋白裂解序列被修改为毒株BC（NDV-VF）。这些NDV载体被设计成可以表达SARS-CoV刺突S糖蛋白，即主要的保护性抗原，证明NDV作为SARS-CoV局部呼吸道疫苗载体的安全性和保护效力。

5.3 NDV的佐剂效应NDV是宿主免疫反应的强刺激因子，从而提供佐剂效应。呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿和老年人严重下呼吸道疾病的主要原因[38]。使用NDV毒株B1表达呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白，NDV作为病毒载体，能够诱导强烈的干扰素（IFN）-α/β反应。研究发现，与之前感染过呼吸道合胞病毒的动物相比，携带NDV的BALB/c小鼠体内出现的CD8+记忆性T细胞数量更多。因此，疫苗病毒提供了针对呼吸道合胞病毒挑战的保护。该项研究强调了NDV载体通过有效的干扰素诱导介导的佐剂效应。

6 结 语

随着养殖业的集约化发展，国内近几年的养殖业规模不断扩大，从而扩大了NDV的传播范围，与此同时，NDV的免疫原性也逐步发生变化，出现了较多强毒株。尽管采用广泛的疫苗接种方法，新城疫（ND）仍然对全球家禽业存在永久威胁。NDV在临床上常与其他细菌或病毒共感染，为临床诊断和治疗增加新的难度，给养殖业带来的影响也越来越大，阻碍了我国养鸡业的规模化发展。目前，国内外越来越重视对ND新型疫苗的研究开发，新城疫病病毒可特异性杀死肿瘤细胞，为病毒溶瘤物的开发带来希望。