Carba plus纸片法测定CRE的碳青霉烯酶的能力评估及与β-内酰胺酶耐药基因的关系

高爽（辽宁省盘锦检验检测中心,辽宁 盘锦 124080）

由于碳青霉烯类抗菌药物的过度使用，耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)菌株的检出率呈上升趋势，产碳青霉烯酶菌株对碳青霉烯类抗菌药物具有耐药性，对几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物都存在耐药，CRE对全球的公共卫生安全都造成了威胁[1]。因此，快速、准确地检测耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌十分必要。目前，主要采用Carba NP试验及碳青霉烯类失活试验法检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶，但以上检测方法只能检测碳青霉烯酶的活性，不能区分碳青霉烯酶的类型，因此，亟需找到一种能快速、准确对碳青霉烯酶类型进行区分的检测方法[2]。Carba plus纸片法通过酶抑制剂原理，通过读取抑菌圈直径区分碳青霉烯酶的类型[3]。碳青霉烯类抗生素是一种常见的广谱抗菌药物，由于广泛应用，耐碳青霉烯类抗生素的细菌不断增加，耐药机制主要为可水解的碳青霉烯类抗生素β-内酰胺酶-碳青霉烯酶产生[4]。为了进一步研究耐碳青霉烯类菌株的耐药原因，本研究旨在探讨Carba plus纸片法检测耐药肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶类型的评估能力及与β-内酰胺酶耐药基因的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集医院2018年6月-2020年6月临床分离非重复的65株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌为研究组，另选取同期分离的68株碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌为对照组。

1.2 仪器与试剂 仪器：VITEK-MS质谱仪和VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏仪、CFX96荧光定量PCR扩增仪、Bio-Rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统、GNP29270型恒温孵育箱、BG-subMIDI(v)可见光电泳透射仪。

试剂：VITEK-MS CHCA基质液、血琼脂平皿和亚胺培南药敏纸、M-H药敏琼脂平皿、Mastdiscs combi Carba plus试剂盒、Premix TaqTM酶、DLl000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker、PCR 扩增试剂、培养基。

1.3 方法

1.3.1 Carba plus纸片法检测 根据纸片扩散法的药敏试验操作步骤，配制0.5麦氏浊度新鲜菌悬液，在MH药敏平皿均匀涂布上，将Carba plus纸片(A-E)、亚胺培南纸片均贴在药敏平板上，使各纸片间保持足够的距离，以便出现清晰的抑制区。于35℃条件下孵育18-24h，对每张纸片的抑菌圈直径进行测量。

1.3.2 耐药基因检测 通过煮沸法对细菌DNA模板进行提取，用特异性引物对碳青霉烯酶基因、β-内酰胺酶耐药基因进行扩增。

1.3.3 PCR检测 PCR体系：Taq PCR Master Mix体系12.5tA，ddH2O 9.5pL，上游引物和下游引物各1弘L，模板DNA1 td。

PCR反应条件：于94℃条件下进行预变性5min；于94℃条件下变性30s，退火30s；于72℃条件下进行延伸；重复变性、退火、延伸，30个循环；于72℃条件下继续延伸7min。将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，再放凝胶成像上进行观察。

1.4 Carba plus纸片法检测碳青霉烯酶的评价 以PCR耐药基因序列分析作为诊断金标准[5]，比较Carba plus纸片法检测碳青霉烯酶的诊断效能。

诊断敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，诊断特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%，诊断准确度=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%。阳性预测值（%）=真阳性/（真阳性+假阳性）×100%。阴性预测值（%）=真阴性/（真阴性+假阴性）×100%。

1.5 统计学分析 以SPSS20.0软件行数据分析，计数资料以[n(%)]形式显示，行χ2检验。

2 结果

2.1 Carba plus纸片法检测结果与耐药基因序列分析结果对比 65株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌菌株Carba plus纸片法检测结果：KPC阳性37株，MBL阳性21株，OXA-48阳性4株，未检测出产酶类型3株；68株碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌菌株均未检测出产酶类型。见表1。

表1 Carba plus纸片法检测结果与耐药基因序列分析结果对比

2.2 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测KPC酶的结果比较 以耐药基因检测作为检测碳青霉烯酶类型的金标准，得到Carba plus纸片法预测肠杆菌科细菌产KPC酶的准确度为94.74%，敏感度为84.44%，特异度为100.00%，阳性预测值为84.44%，阴性预测值为100.00%。见表2。

表2 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测KPC酶的结果比较

2.3 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测MBL酶的结果比较 以耐药基因检测作为检测碳青霉烯酶类型的金标准，得到Carba plus纸片法预测产MBL酶的准确度为97.74%，敏感度为100.00%，特异度为97.37%，阳性预测值为86.36%，阴性预测值为100.00%。见表3。

表3 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测MBL酶的结果比较

2.4 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测OXA-48酶的结果比较 以耐药基因检测作为检测碳青霉烯酶类型的金标准，得到Carba plus纸片法预测产OXA-48酶的准确度为99.25%，敏感度为100.00%，特异度为99.23%，阳性预测值为100.00%，阴性预测值为100.00%。见表4。

表4 Carba plus纸片法与PCR耐药基因序列分析检测OXA-48酶的结果比较

2.5 耐药基因扩增结果 65株CRE中有24株菌产碳青霉烯酶，其中18株CRE同时携带其他β-内酰胺酶耐药基因；65株CRE中有39株产CTX-M型ESBL酶，3株CRE产DHA-1型质粒介导的AmpC酶。

3 讨论

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，对产超广谱β-内酰胺酶及AmpC酶的细菌具有较强的抗菌作用[6-8]。由于CRE的耐药形势十分严峻，且耐药机制较多样，发生CRE感染会导致严重的后果，对CRE菌株进行快速、正确的诊断，有助于区别产酶类型，有助于明确感染暴发的流行本质[9]。Carba plus纸片法是一种鉴定产碳青霉烯酶类型的新方法，通过酶抑制剂原理，读取抑菌圈直径，以对KPC型、MBLs型、OAX-48型碳青霉烯酶进行区别，在鉴定产酶时还能够分析菌株的产酶类型，为控制医院感染提供实验室依据[10-11]。随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，耐药的细菌不断增加，认为其耐药机制与碳青霉烯酶的产生有关[12]。

本研究结果显示，Carba plus纸片法预测产KPC酶的敏感度仅为84.44%。考虑原因可能与KPC基因的编码质粒出现转移有关[13]。Carba plus纸片法预测产MBL酶的敏感度、阴性预测值均为100.00%，但阳性预测值仅为86.36%。考虑原因与选取的产MBL酶菌株的基因型种类不全有一定的关系[14]。Carba plus纸片法预测产OXA-48酶的特异度为99.23%，没有达到100.00%。考虑原因可能为Carba plus纸片中有替莫西林，替莫西林使肺炎克雷伯杆菌产生耐药，出现假阳性，使产OXA-48酶的特异度变低[15]。

综上所述，Carba plus纸片法可准确区别CRE菌株的产酶类型；CRE的碳青霉烯酶的耐药机制为携带KPC型的碳青霉烯酶基因，与β-内酰胺酶耐药基因有关。