抗血管内皮生长因子玻璃体内注射对形觉剥夺性近视豚鼠视网膜中多巴胺水平的影响△

邱 宇 高洪莲 于 睿 李欣蒙 崔钰莹 张 磊

近视是最常见的眼部疾病[1-3]，高度近视眼底病变是致盲的主要原因[4]。东亚和东南亚一些地区的青少年近视率为80%～90%[5]，青少年的视力健康问题日益突出。多种视网膜信号分子已被证实与近视的发生和发展息息相关，如多巴胺(DA)、胰高血糖素、乙酰胆碱等，其中，DA作为视网膜中一种重要的神经递质，可以调节视觉信号和屈光发育[6]。大量研究表明，玻璃体内注射DA或DA受体激动剂可以抑制形觉剥夺性近视形成，DA是近视发展的停止信号[7-8]。血管内皮生长因子(VEGF)对多巴胺能神经元有保护、修复和营养的作用[9]，而当VEGF水平降低时，DA相关疾病阿尔茨海默病(AD)的风险增加[10]，基于此，我们推测玻璃体内注射抗VEGF药物可能会影响视网膜中DA水平。本研究通过建立形觉剥夺性近视(FDM)模型，探讨抗VEGF药物康柏西普(Conbercept)玻璃体内注射对FDM豚鼠视网膜中DA水平的影响及其作用机制，为近视相关DA信号通路和近视防控研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物取健康3周龄英国短毛三色豚鼠60只(济南西岭角养殖繁育中心提供)，雌雄不限，体重150～200 g。本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会审批，实验动物的喂养和使用严格遵循滨州医学院动物管理委员会相关规定。

1.1.2 主要试剂与仪器10 g·L-1Conbercept(成都康弘生物科技有限公司)；复方托吡卡胺滴眼液(参天制药中国有限公司)；Davidson固定液(北京索莱宝生物科技有限公司)；OCT冰冻切片包埋剂(美国Sakura公司)；兔抗鼠TH多克隆抗体(英国Abcam公司)；山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)；带状光检影镜(苏州六六视觉科技有限公司)；A型超声(法国Quantel公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；正置荧光显微镜(日本Olympus公司)；高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及FDM模型构建60只3周龄三色豚鼠，按照随机数字表法分为空白对照组、FDM组、FDM+生理盐水组、FDM+Conbercept组，每组15只。空白对照组豚鼠双眼不作任何处理，其余3组豚鼠采用半透明无毒乳胶气球套头，修剪气球暴露左眼、口鼻和耳部，遮盖右眼2周建立FDM模型。

1.2.2 玻璃体内Conbercept注射造模前10 min对FDM+生理盐水组和FDM+Conbercept组豚鼠进行玻璃体内注射药物1次，所有实验均在右眼操作，提前1 d使用左氧氟沙星滴眼液滴右眼(每天3次)。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，碘伏消毒眼周，聚维酮碘消毒结膜囊后用生理盐水冲洗干净，根据分组分别向FDM+生理盐水组和FDM+Conbercept组注射0.002 mL生理盐水和0.02 mg(0.002 mL)Conbercept，注射后左氧氟沙星滴眼液滴眼(每天3次)。

1.2.3 眼部生物学参数测量分别在遮盖前和遮盖2周后测量各组豚鼠的屈光度和眼轴长度。测量屈光度前，复方托吡卡胺滴眼液滴右眼，睫状肌充分麻痹后使用带状光检影镜验光，达到满圆时记录中和度数，并加上工作距离，连续测量5次取平均值。测量眼轴长度前，盐酸丙美卡因滴眼液滴右眼，角膜表面麻醉后使用眼部A超测量眼轴长度，设置前房声速 1557.5 m·s-1，晶状体声速1723.3 m·s-1，玻璃体声速1540 m·s-1，增益调整至中等，测量模式选择手动测量，连续测量5次取平均值。

1.2.4 免疫荧光法检测豚鼠视网膜中酪氨酸羟化酶的表达颈椎脱臼处死各组豚鼠，冰上摘取右眼眼球，置于Davidson固定液中，3 h后取出眼球，去除角膜、虹膜、晶状体和玻璃体，制成眼杯，依次放入100 g·L-1、200 g·L-1和300 g·L-1的蔗糖溶液中梯度脱水，充分脱水后取出眼杯，吸水纸去除多余溶液，OCT包埋，冰冻切片机速冻、切片，制备冰冻切片，4 ℃丙酮处理10 min，自然风干，1倍磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次10 min；3 g·L-1Triton x-100洗3次，每次10 min；PBS洗3次，每次10 min；滴加50 g·L-1BSA封闭液，37 ℃孵育30 min;滴加兔抗鼠酪氨酸羟化酶(TH)多克隆抗体(11000)，4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次10 min；滴加山羊抗兔IgG(1500)，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次10 min；滴加含DAPI的封片剂封片，正置荧光显微镜观察拍照。

1.2.5 高效液相色谱法检测豚鼠视网膜中DA和3,4-二羟基苯乙酸的含量颈椎脱臼处死各组豚鼠，冰上摘取右眼眼球，快速分离视网膜并称重，加入匀浆液，-40 ℃匀浆，4℃离心，取上清后上样检测。使用HPLC-ECD检测系统检测DA和3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)含量。色谱柱为 Acclaim C18色谱柱(2.2 μm，2.1×100 mm)，流动相含90 mmol·L-1NaH2PO4、50 mmol·L-1柠檬酸、1.7 mmol·L-1OSA、50 μmol·L-1EDTA和36 g·L-1乙腈，流速为0.2 mL·min-1，柱温保持在38 ℃，检测池电压设置350 mV，Guard Cell 电压设置360 mV。所有数据均由Chromeleon 6.9色谱工作站进行采集与分析，以内标法计算目标物含量。

1.3 统计学方法采用统计学软件SPSS 24.0进行统计分析。本研究的计量资料数据经W检验呈正态分布，以均数±标准差表示，组间数据经Levene检验方差齐性。各组数据总体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 豚鼠眼部生物学参数分析遮盖前，4组豚鼠双眼均呈远视状态，各组豚鼠间的屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。遮盖2周后，与空白对照组相比，FDM组、FDM+生理盐水组、FDM+Conbercept组豚鼠的屈光度和眼轴长度差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与FDM组比较，FDM+生理盐水组豚鼠屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与FDM组和FDM+生理盐水组相比，FDM+Conbercept组豚鼠近视度升高，眼轴长度延长，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 4组豚鼠建模前后屈光度和眼轴长度的比较

2.2 免疫荧光检测结果免疫荧光检测结果显示，各组豚鼠视网膜厚度正常，结构完整，视网膜中TH表达呈绿色点状荧光(图1箭头指示区域)，主要位于无长突细胞层。空白对照组表达TH的细胞数量为(36.250±6.112)个，FDM组和FDM+生理盐水组表达TH的细胞数量分别为(26.125±4.454)个和(25.875±4.121)个，较空白对照组均降低(均为P<0.05)。与FDM组和FDM+生理盐水组相比，FDM+Conbercept组表达TH的细胞数量[(18.375±3.889)个]均更低(均为P<0.05)。

2.3 高效液相色谱法检测结果4组豚鼠视网膜中DA和DOPAC的色谱分离图见图2，根据出峰时间确定其所代表的物质，计算各物质峰面积与内标峰面积的比值，最后将比值带入标准曲线方程得出所测物质的含量，结果显示，遮盖2周后，与空白对照组比较，FDM组、FDM+生理盐水组、FDM+Conbercept组的DA和DOPAC差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与FDM组比较，FDM+生理盐水组DA和DOPAC差异均无统计学意义(均为P<0.05)；与FDM+生理盐水组比较，FDM+Conbercept组DA和DOPAC含量均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；4组间的DA代谢率差异无统计学意义(P=0.964)(表2)。

视网膜中TH表达呈绿色点状荧光(箭头指示区域)，细胞核呈蓝色荧光；ONL：视网膜外核层；INL：视网膜内核层。图1 豚鼠视网膜中TH的表达(×400)

A:标准品色谱图；B:空白对照组色谱图；C：FDM组色谱图；D：FDM+生理盐水组色谱图；E：FDM+Conbercept组色谱图。图2 豚鼠视网膜中DA和DOPAC的色谱分离图

表2 各组豚鼠视网膜中DA、DOPAC的含量

3 讨论

视网膜DA系统对正常视觉发育至关重要，在动物近视模型的视网膜中，DA水平会显著降低[11]，缺乏视网膜DA信号会导致近视的发展[12]，而通过注射DA激动剂可抑制近视发展[13]，这表明DA是近视的停止信号，对视觉有保护作用。DA有5种受体，根据DA受体对腺苷酸环化酶活性的不同影响，可分为D1类受体和D2类受体[14]。有研究表明，DA受体激动剂在近视中的抑制作用是通过激活D2类受体介导的[15]，但也有部分研究表明，D1类和D2类受体的激活达到平衡状态对抑制近视的发生发展也很重要[16]。DA在近视发展中的作用是复杂的，在FDM和透镜诱导性近视(LIM)之间的作用机制可能并不相同，DA在抑制FDM中更为显著，在抑制LIM中相对不明显，存在更多的争议[17]。本研究选择建立FDM模型，观察注射抗VEGF药物后FDM中视网膜DA的变化以及豚鼠的屈光状态。

DA是儿茶酚胺类物质，其合成起自于酪氨酸，酪氨酸在TH的作用下转化为左旋多巴，再经左旋多巴脱氢酶的作用转化为DA[18]，在视网膜中主要由无长突细胞分泌，代谢产物为DOPAC，其中，TH为DA生成的主要限速酶，DOPAC反映了DA的释放量[19]。本研究结果显示，与空白对照组的轻度远视状态相比，FDM组豚鼠右眼变为近视状态，眼轴长度延长，视网膜中DA和DOPAC的含量、TH的表达均下降，DA/DOPAC比值不变，这与Feldkaemper等[20]的研究结果一致。而与FDM组和FDM+生理盐水组豚鼠相比，FDM+Conbercept组豚鼠右眼更为向近视方向偏移，视网膜中DA和DOPAC的含量进一步下降，DA的合成限速酶TH的表达更弱，DA代谢率依然未变，这表明注射Conbercept后FDM+Conbercept组豚鼠DA水平降低，并可分析出其降低可能是因为DA的合成减少而非代谢增多。

VEGF是一种促血管内皮细胞生长因子，可增加血管通透性、促进血管内皮细胞迁移，对血管内皮细胞具有增殖和抗凋亡作用。VEGF家族主要成员有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F 、PIGF等[21-22]，其中，VEGF-A、VEGF-B、PIGF对各种类型的神经元，包括多巴胺能神经元有神经保护、修复和营养作用[9]，而当VEGF水平降低时，患AD的风险随之增高[23]。同时，内源性视网膜VEGF-A在维持视网膜神经细胞的存活和缺血预处理介导的视网膜神经保护中发挥着重要的作用[24]，并可刺激神经元细胞相关的多个信号因子，包括Akt、 ERK等[25-26]。Conbercept是一种相对分子质量为143 000的抗VEGF人源化重组融合蛋白，作用靶点为VEGF-A、VEGF-B和PIGF[27]。抗VEGF药物Conbercept玻璃体内注射引起DA水平下降及近视度升高的机制可能是Conbercept阻断了VEGF-A、VEGF-B、PIGF与受体结合，影响了视网膜DA神经系统的活性，导致DA的合成减少，DA水平下降，视网膜缺乏DA信号，促使屈光状态进一步向近视方向偏移。

综上所述，本研究进一步验证了DA和近视之间的紧密联系，也证实了玻璃体内注射抗VEGF药物会使FDM豚鼠视网膜中的DA水平更低，并导致豚鼠眼轴延长、近视度升高，其作用机制可能是抗VEGF药物影响了视网膜多巴胺能神经元的活性，导致TH水平下降，DA合成减少，DA水平下降，屈光状态进一步向近视方向偏移，但具体的信号通路尚不明确，且本实验仅能证明0.02 mg的Conbercept玻璃体内注射对豚鼠视网膜DA水平及屈光状态的影响，抗VEGF药物对豚鼠的此种影响是否存在药物剂量依赖关系以及VEGF或VEGF受体激动剂是否可以抑制近视的发生发展，需要进一步的实验研究。本研究为近视相关DA信号通路和近视防控研究提供了新的思路和实验基础。