添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长的影响研究

石 杰， 宋淑敏，魏连会，董 艳，杨庆丽

（黑龙江省科学院 大庆分院，黑龙江 大庆 163319）

啤酒酵母是啤酒生产过程中的常用酵母，不但可以用于酿造啤酒，由于其菌体营养丰富，还可以提取维生素、细胞色素 C、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶 A 和三磷酸腺苷等[1-3]，从而用于药膳及饲料[4]，成为新时期保健食品研制的热点话题。在啤酒酵母的培养过程中，氮源的含量、组成及种类能够显著影响酵母细胞的组成和关键物质的合成途径[5-6]。在酿制啤酒过程中，添加氮源种类和含量不同不但对啤酒的发酵度有显著影响，同时对成品啤酒的理化性质及风味也起着主导作用[7-9]。为提高啤酒酵母在发酵过程中的生物量及发酵速率，增加啤酒发酵成品中的营养成分，补充氮源成为一种可行的有效办法[10]。

汉麻 （CannabisSativaL） 在我国有着悠久的种植历史，汉麻籽富含优质蛋白[11-12]及合理的必需氨基酸和非必需氨基酸比例，特别是含有大量人体代谢需要的精氨酸，不含致敏因子，不会造成胃胀、反胃和过敏反应[13-14]。研究还发现，汉麻籽多肽具有很好的抗氧化性能和降血脂作用[15-16]。因此，将汉麻籽多肽作为补充氮源，研究一株购自日本的啤酒酵母在 添 加 汉 麻 籽 多 肽 前 后 的 生 长 变 化 ， 为 提 高 啤 酒 酵母生产效率、加速啤酒酿造提出一条新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（1） 汉麻籽多肽。课题组自行研制 （<5 000 amu）；啤酒酵母、大麦芽、啤酒花，日本新瀉麦酒株式会社提供。

（2） 麦芽汁培养基。蛋白胨 4 g，葡萄糖 10 g，酵母浸粉 3 g，麦芽浸粉 10 g，琼脂粉 18 g （固体），蒸馏水 1 000 mL，于 121 ℃下灭菌 30 min。

（3） YEPD 培养基。酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g溶解于 900 mL 蒸馏水中 （固体培养基中另加入琼脂粉 18 g）；另取 20 g 葡萄糖溶于 100 mL 蒸馏水中；分别于 121 ℃下灭菌 30 min；使用前于无菌环境下混合。

盐酸，氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FE28-Standard 型 pH 计，瑞士梅特勒公司产品；UV759S 型紫外 - 可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BK5000 型生物显微镜，OPTEC 奥特光学产品；HPX-9082 MBE 型恒温培养箱，上海博迅实业有限公司产品；DHG-9070A 型鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 不同添加量汉麻籽多肽对啤酒酵母生长的影响

在 YEPD 培养基 （除葡萄糖溶液） 中将总体积占比 0.5%和 1%添加量的汉麻籽多肽粉灭菌，接种酵母前于无菌环境中按比例混合已灭菌葡萄糖溶液，同时制备对照培养基并灭菌。各处理接种已培养 24 h 的啤酒酵母种子培养液 1 mL，于恒温培养箱中 28 ℃培养 24 h 后进行平板计数、菌体干重测定和显微镜镜检。

（1） 菌体干重测定。取各处理 10 mL 菌悬液，以转速 4 000 r/min 离心 20 min，弃上清液，加入10 mL蒸馏水重悬酵母，再次以转速 4 000 r/min 离心 20 min，弃去上清液，105 ℃下烘干 3 h，称得菌体干重。

（2） 显微镜镜检。为方便观察和拍照，固定菌体后进行了结晶紫染色。

1.3.2 添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长曲线的影响

麦芽汁液体培养基共准备 48 瓶，每瓶 50 mL，其中 24 瓶中分别添加总体积占比 0.5%添加量的汉麻籽多肽粉。灭菌后 48 瓶同时接种已培养 24 h 的啤酒酵母种子培养液 100 μL，28 ℃，以转速 180 r/min摇瓶培养。以原始培养基为零标，采用分光光度计分别检测 2 种培养基 3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36 h 时的 OD600值，建立生长曲线。

1.3.3 汉麻籽多肽精酿啤酒工艺流程

粉碎大麦芽→糖化→煮沸→过滤→冷却→接种啤酒酵母→主发酵→后熟→成品。

1.3.4 操作要点

（1） 糖化。粉碎大麦芽 100 g 加入蒸馏水 500 mL，加热至 65 ℃持续 90 min，继续加热至 80 ℃持续30 min。

（2） 煮沸。添加 1 g 啤酒花，将糖化好的麦汁煮沸 30 min。

（3） 冷却。过滤后室温冷却至 30 ℃。

（4） 接种啤酒酵母。直接将培养好的啤酒酵母平板中的啤酒酵母刮取后混入冷却液 （1 盘 / 100 mL）。

（5） 主发酵。发酵温度 8～20 ℃，发酵 7 d。

（6） 后熟。主发酵后将发酵液置于 6 ℃冷藏室15 d，去除酵母和沉淀物，得到汉麻籽多肽精酿啤酒。

1.3.5 汉麻籽多肽精酿啤酒中啤酒酵母活菌数正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用正交试验设计，以精酿啤酒后熟的酵母活菌数量为评价指标，对主发酵温度 （A）、汉麻籽多肽添加量 （B） 和汉麻籽多肽添加时期 （C） 进行正交试验，研究提高酵母活菌数的条件组合。

正交试验因素与水平设计见表 1。

表1 正交试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 啤酒酵母序列鉴定

采用提取 DNA，设计引物进行 PCR 后测序的方法进行了啤酒酵母菌种的鉴定，测序结果如下：

试验结果中该菌株被鉴定为Saccharomyces（酵母 菌 属）， 为Saccharomycescerevisiae（啤 酒 酵 母）。确定菌种后即可进行其他相关研究。

2.2 不同添加量汉麻籽多肽对啤酒酵母生长的影响

不同添加量的汉麻籽多肽 YEPD 培养基中啤酒酵母的活菌数及菌干重见表 2。

表2 不同添加量的汉麻籽多肽 YEPD 培养基中啤酒酵母的活菌数及菌干重

由 表 2 可 知 ， 在 YEPD 培 养 基 中 添 加 0.5% 和1%含量的汉麻籽多肽均可以增加培养基中酵母菌的活菌数和菌干重。其中，添加量 1%的汉麻籽多肽可以提高活菌数 18.67%，添加量为 0.5%的汉麻籽多肽可以提高菌干重 11.12%。而添加量为 1%的汉麻籽多肽对酵母菌干重的增加量少于添加量为 0.5%的汉麻籽多肽，说明添加过多汉麻籽多肽仅仅可能增加啤酒酵母活菌数，不能增加酵母菌干重。

不同汉麻籽多肽添加量的培养基中酵母菌的形态见图 1。

图1 不同汉麻籽多肽添加量的培养基中酵母菌的形态

由图 1 可知，没有添加汉麻籽多肽和添加量为0.5%汉麻籽多肽 YEPD 培养基中的啤酒酵母平均直径要大于添加 1%汉麻籽多肽的 YEPD 培养基中的啤酒酵母。同样证明了添加过量汉麻籽多肽仅对增加啤酒酵母的数量有益，对啤酒酵母的干重增加影响不大。

不同汉麻籽多肽添加量的培养基培养酵母后的状态见图 2。

在 YEPD 培养基中添加 0.5%和 1%汉麻籽多肽后，培养基的颜色与对照是相同的，由图 2 可知，随着汉麻籽多肽添加量的增加，培养啤酒酵母后培养基的颜色越深。可能是因为啤酒酵母数量随着汉麻籽多肽添加量的增加而增加，培养基中的营养被利用，同时产生了大量深色代谢产物，从而导致培养基的颜色加深。具体产生了哪些代谢产物使培养基颜色加深还需要进一步研究。

图2 不同汉麻籽多肽添加量的培养基培养酵母后的状态

2.3 添加汉麻籽多肽对啤酒酵母生长曲线的影响

啤酒酵母在不同培养基中的生长曲线见图 3。

图3 啤酒酵母在不同培养基中的生长曲线

由图 3 可知，添加汉麻籽多肽的麦芽汁培养基与普通麦芽汁培养基中啤酒酵母的生长曲线。二者的趋势一致，均在 6 h 后进入指数生长期，并在 15 h 开始进入稳定期。指数生长后期，12 h 左右汉麻籽多肽麦芽汁培养基中酵母数量即超过了普通麦芽汁培养基中的酵母数量，并一直持续至 36 h。这与 2.2 的研究结果相一致。

2.4 汉麻籽多 肽 添加量、添加时期 及 主发 酵 温 度对啤酒酵母在精酿啤酒中活菌数量的影响

根据单因素试验结果对主发酵温度 （A）、汉麻籽多肽添加量 （B） 和汉麻籽多肽添加时期 （C） 3 个因素进行正交试验，探讨对啤酒酵母活菌数影响最大的变量。

正交试验结果见表 3。

由表 3 可知，影响啤酒酵母在精酿啤酒中活菌数量的各因素主次关系为A>B>C，其中主发酵温度对精酿啤酒中啤酒酵母的数量影响显著，其次是汉麻籽多肽的添加量。得出提高精酿啤酒活菌数量的最佳条件为A1B2C3，即主发酵温度为 8 ℃，汉麻籽多肽添加量为 0.5%，并在主发酵后添加。添加了汉麻籽多肽的精酿啤酒呈黄棕色，较普通啤酒颜色更深，但口感细腻醇厚、香气独特。

表3 正交试验结果

3 结论

添加 0.5%或 1%的汉麻籽多肽都可以提高 YEPD培养基中啤酒酵母的活菌数和菌干重，且汉麻籽多肽添加量越多，啤酒酵母活菌数越高，过多汉麻籽多肽不能再增加啤酒酵母的菌干重，说明添加汉麻籽多肽可以提高啤酒酵母的裂殖活性，但由于碳源或其他营养因素的限制，不能提高啤酒酵母的菌干重，镜检结果也说明了同样的问题。添加和不添加汉麻籽多肽的麦芽汁培养基中啤酒酵母的生长曲线是相似的，但指数生长后期汉麻籽多肽麦芽汁培养基中啤酒酵母数量要高于普通麦芽汁培养基中啤酒酵母数量。

影响啤酒酵母在精酿啤酒中活菌数量的各因素主次关系为主发酵温度 > 汉麻籽多肽添加量 > 汉麻籽多肽添加时期，提高精酿啤酒活菌数量的最佳条件为主发酵温度 8 ℃，汉麻籽多肽添加量 0.5%，并在主发酵后添加。可能是添加了适量的汉麻籽多肽补充了主发酵后啤酒酵母增殖所需要的氮源，在后熟过程中又促进了酵母的增殖。因此，添加汉麻籽多肽对啤酒酵母的增殖具有重要意义，是一种提高啤酒酵母生产效率、提高啤酒品质的一条重要途径。