慢性肾脏病血管钙化的生物标志物

焦咏宜 综述 张晓良 审校

血管钙化(VC)是慢性肾脏病(CKD)最常见的并发症之一,最新的流行病学调查显示,中国透析患者的VC患病率已高达77.4%[1]。VC与心血管疾病(CVD)高发病率及高死亡率密切相关,因此寻找可靠的生物标志物对于CKD患者VC早期诊断、预后评估和治疗十分重要。本文将对VC生物标志物研究的最新进展进行综述。

维生素K依赖性蛋白(VKDPs)

VKDPs是一类需要维生素K作为辅助因子翻译修饰后才能发挥生物活性的蛋白质,与VC及CVD的发生密切相关。VKDPs主要分为两类,一类是与维生素K1相关的凝血因子,另一类是与维生素K2相关的钙化相关因子。近年来多项研究均表明维生素K2具有抑制VC的作用。

基质γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)MGP是一种维生素K依赖的钙化抑制因子,在钙磷沉积的血管平滑肌细胞(VSMCs)中高度表达。循环中存在四种不同类型的MGP,即去磷酸化未羧化MGP(dp-uc MGP)、去磷酸化羧化MGP(dp-c MGP)、磷酸化未羧化MGP(p-uc MGP)和磷酸化羧化MGP(p-c MGP)。MGP可以通过螯合钙离子、抑制骨形态发生蛋白2(BMP-2)形成、结合基质囊泡和抗凋亡等途径抑制VC。研究表明,MGP基因敲除的小鼠会出现软骨过度、生长板矿化和动脉中膜钙化,可导致早期死亡[2]。

dp-uc MGP在VC早期诊断、进展和预后评估方面具有重要价值。一项以CKD 3～5期患者为研究对象的研究表明随肾脏功能减退,dp-uc MGP的水平不断升高,且与VC程度呈正相关[3]。同时,一项包括136例血液透析患者的队列研究表明,dp-uc MGP与VC分数显著相关[4]。Mayer等[5]则在799例合并CVD的患者中发现,dp-uc MGP可独立预测心血管死亡率及全因死亡率。

维生素K是MGP羧化过程中必需的辅助因子,应用华法林或者维生素K缺乏会导致MGP羧化不足和功能受损,dp-uc MGP水平上升。预防及延缓VC主要是选择补充维生素K2,而dp-uc MGP是评估血管内维生素K状态的最佳生物标志物[2]。一项涉及200例血液透析患者的前瞻性随机单盲研究显示,补充维生素K2可剂量依赖性地降低dp-uc MGP水平[6]。

总之,dp-uc MGP是 VC早期诊断和预后评估最重要的指标,是目前最有希望应用于临床的生物标志物,同时也可以用于评估血管内维生素K状态。

骨钙素(OC)OC是由成骨细胞合成和分泌的骨γ羟基氨酸蛋白,是一种VKDP,它可以反映骨骼的动态变化。OC包括羧化不全骨钙素(ucOC)和羧化完全骨钙素(cOC)。

OC与VC密切相关,但其作用机制尚不明确。目前研究认为OC是钙化促进因子,可以通过缺氧诱导因子信号途径、Runx2信号等途径促进VC。cOC则对羟基磷灰石晶体具有强亲和力,与其结合后可促进VC。

OC是骨代谢的一项重要生物标志物,但其能否作为VC的生物标志物尚存在争议。在临床研究中,一项涉及108例维持性血液透析患者的横断面研究表明,CKD患者OC水平显著升高,且升高水平与血磷、甲状旁腺激素、成纤维细胞生长因子23(FGF-23)呈正相关,因此认为OC是VC的危险因素[7]。但有病例对照研究与荟萃分析表达了相反的观点,认为在CKD患者和普通人群中均不能证明OC与VC之间存在某种关系[8-9]。

ucOC除了作为维生素K评价指标外,可能与VC也存在某种联系。近年来研究者发现ucOC可以通过刺激PI3K/Akt信号通路、上调血管内皮细胞中一氧化氮和核因子κB(NF-κB)的表达,从而发挥保护内皮功能、抑制VC的作用。Qaradakhi等[10]分别以正常饮食与ucOC喂食合并有动脉粥样硬化的白兔,结果表明ucOC可以改善动脉粥样硬化后受损的内皮依赖性血管舒张功能。但在一项21d的体外研究中却未观察到ucOC对VC的积极作用[8]。因此未来研究中可以更加关注ucOC与VC之间的关联。

焦磷酸盐(PPi)

PPi是以胞外三磷酸腺苷(ATP)为原料的钙化抑制因子,可以抑制羟基磷灰石的形成和生长。PPi与以下两种酶密切相关:(1)组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)能够抑制PPi,促进VC形成。采用小分子化合物选择性抑制TNAP是靶向治疗VC的最新策略,Tani等[11]在CKD-MBD小鼠模型中,使用新型TNAP抑制剂SBI-425可以抑制VC形成、降低死亡率,且不影响正常骨骼形成和残余肾功能;(2)外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I (eNPP I)可以水解胞外ATP产生PPi,是循环中PPi的主要来源,在敲除eNPPI基因的小鼠中,其PPi显著降低,促进VC发生[12]。

在临床研究中,PPi也被证明与VC密切相关。O’Neill等[13]发现PPi水平与CKD患者的VC呈负相关,且不受是否透析、透析方式、营养状态及炎症状态等因素的影响,可成为评价VC发生与进展的生物学标志物。

骨保护素(OPG)

OPG可直接抑制破骨细胞的分化成熟和诱导成骨细胞的发生,是重要的钙化抑制因子。OPG也可通过OPG/NF-κB受体活化因子(RANK)/RANK配体(RANKL)系统抑制VC,RANK由破骨细胞分泌,而OPG及RANKL则由成骨细胞分泌合成,当OPG受到Wnt/β-catenin途径的调节而竞争性结合RANKL时,可以抑制RANKL与RANK在破骨细胞上的结合,从而抑制骨吸收。

动物试验普遍认为OPG是VC的保护因素,OPG可以抑制大鼠VSMC向成骨细胞分化。在小鼠钙化血管中,RANKL表达水平较高,且OPG表达水平较低。然而,大量临床试验研究结果与动物试验相反,提出OPG升高可能是预测死亡风险的有效生物学标志物。Tschiderer等[14]在一项涉及26 442例普通人群的荟萃分析中认为OPG水平的升高与普通人群发生CVD的风险增加有关。Morena等[15]在195例非透析CKD患者中发现高OPG与中度冠状动脉钙化(评分100～400)密切相关,是其强有力的生物学标志物。Morena等[16]也在一项涉及185例血液透析患者的队列研究中表明OPG水平升高是全因死亡率和心血管死亡率的独立预测因子。目前多项临床研究认为OPG在VC风险预测方面具有重要价值,该指标具有良好的临床转化前景。

FGF-23与Klotho蛋白

FGF-23是一种由骨细胞和成骨细胞分泌的激素蛋白,是调节CKD患者磷酸盐的重要因子。Klotho蛋白是FGF-23发挥生理功能的重要辅助因子,它是一种单跨膜蛋白,主要包括α、β和γ三种形式,其中α-Klotho(αKL)又可以分为可溶性αKL(cKL)与膜型αKL。FGF-23发挥活性需要与FGF受体(FGFR)和Klotho共受体相结合,其中Klotho共受体可以促进FGF-23与FGFR结合。

FGF-23主要通过以下机制在肾脏中发挥作用:(1)在近端肾小管,FGF-23/FGFR1/Klotho复合体能够直接激活ERK1/2和SGK1,从而抑制钠磷协同转运子的表达,诱导尿磷增加;(2)下调25-羟维生素D1-α-羟化酶表达,从而减少骨化三醇的合成和磷酸盐的吸收。Klotho蛋白则是通过与FGF-23联合作用降低血磷以及直接抑制VSMC向成骨细胞表型的分化这两种途径抑制VC。

FGF-23的升高与Klotho蛋白的降低在CKD患者VC形成过程中均起着关键作用,可作为VC早期诊断和预后评估的生物标志物。在合并VC的CKD患者中往往会出现Klotho蛋白缺乏,同时FGF-23水平因磷酸盐沉积而反馈性上升,高水平FGF-23、低水平cKL蛋白与CVD及全因死亡率密切相关[17-18]。Morena等[15]在195例非透析CKD患者中发现高水平FGF-23与重度冠状动脉钙化(评分>400)密切相关,是重度VC可靠的预测因子。

Klotho蛋白是VC新的治疗靶点,在CKD-MBD的小鼠模型中,持续的cKL治疗可以降低高磷血症、预防VC[19]。研究者发现多种药物可通过上调Klotho蛋白治疗VC, Klotho蛋白水平可作为评价治疗效果的有效指标:(1)雷帕霉素可通过抑制雷帕霉素靶蛋白信号从而上调cKL的表达,有效地抑制VC[20];(2)Intermedin1-53(IMD1-53)是一种降钙素/降钙素基因相关肽,在动物研究中发现IMD1-53可通过CRLR/RAMP3受体复合物和激活cAMP/PKA信号传导来上调αKL水平,从而抑制VC[21]。

钙蛋白颗粒

胎球蛋白A是一种钙化抑制因子,可以与钙磷结合形成蛋白质-矿物复合物,即钙蛋白单体。钙蛋白单体聚合后可形成血浆可溶性无定形胶体颗粒,称为初级钙蛋白颗粒(CPPⅠ)。CPPⅠ在血浆中循环,最终重排成直径更大、不溶于血清、具有针状晶体结构次级钙蛋白颗粒(CPPⅡ)[22]。CPP可以通过诱导VSMC内膜增生、促炎、诱导氧化应激及上调钙化促进因子等途径诱导VC,CPPⅡ在其中发挥主要作用。

CPPⅠ自发转换成CPPⅡ所需时间的一半称为T50,是评价VC倾向的最佳生物标志物,与低T50相比,高T50更不容易出现VC。多项研究表明T50具有极大的临床应用价值,在CKD患者中,低T50和高CPPⅡ与VC程度正相关,与CVD、全因死亡率的增加亦密切相关[23-24]。

降低CPP水平是VC治疗的一个新方向,在治疗过程中CPP水平及T50可作为治疗效果的一个重要观察指标。目前主要存在以下几种方式:(1)镁盐(Mg2+):Bressendorff等[25]发现在提高透析液中Mg2+浓度可增加T50,从而降低钙化倾向。(2)磷酸盐结合剂:Smith等在使用司维拉姆减轻钙化程度的同时观察到血清中CPPⅠ水平显著降低[26],Thiem等[27]通过羟基氢氧化亚铁降低磷酸盐水平减轻VC时发现T50显著延长。(3)拟钙剂依替卡列肽注射溶液目前用于治疗继发性甲状旁腺功能亢进,有研究表明该药也可以抑制VC倾向,延长T50[28]。因此, CPP及T50有望成为评价VC的治疗及预后效果的重要生物标志物。

Wnt/β-catenin抑制剂

Wnt/β-catenin是一种细胞内信号通路,可调节成骨细胞活性,在骨形成中起关键作用。该途径的激活始于Wnt配体和其受体、卷曲蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5/6结合,使糖原合成酶激酶3失活,从而稳定细胞质中的β-catenin并使其进入细胞核内,启动骨形成基因的转录。骨硬化蛋白与Dickkopf-1(Dkk-1)均为分泌型糖蛋白,可以通过抑制Wnt/β-catenin途径从而抑制成骨细胞分化。

骨硬化蛋白骨硬化蛋白是由骨细胞分泌,通过与LRP5/6结合抑制成骨细胞的Wnt信号传导途径、影响BMP的活性、调节骨化三醇和FGF-23分泌等途径抑制成骨细胞的分化。

目前,关于骨硬化蛋白是否能成为CKD患者VC早期诊断与预后评估的敏感生物标志物尚存在争议。Yang等[29]观察到125例维持性血液透析患者的骨硬化蛋白与VC及CVD呈负相关,即骨硬化蛋白是VC的保护性因素。同样,Jean等[30]在207例血液透析患者中发现，较高的血清硬化素水平与较高的骨密度、较低的主动脉钙化积分及较高的生存率相关。但该结论尚存在争议,Wang等[31]在161例CKD 3～5D期患者中发现，其血清骨硬化蛋白水平与腹主动脉钙化呈正相关,但是与钙化程度呈负相关。Qureshi等[32]在89例终末期肾病患者中发现，高水平的骨硬化蛋白与VC发生呈正相关,且认为高水平骨硬化蛋白可以作为预测VC发生的指标。

Dkk1Dkk1主要由成骨细胞和骨细胞分泌表达,其抑制VC主要是通过与LRP5/6相结合从而抑制Wnt信号通路,可抑制成骨细胞产生OPG,增加RANKL/OPG比例和破骨细胞活动。

近年研究发现Dkk1有望成为VC临床诊断及预后评估的新型生物标志物。Thambiah等[33]发现在未透析的CKD的患者中,Dkk1水平与骨密度和动脉僵硬度成负相关。Lee等[34]研究表明在透析患者中,Dkk1水平与腹主动脉钙化程度称负相关。在一项涉及706例普通人群的前瞻性研究中,Dkk1水平与CVD密切相关,其中以脑卒中事件为主[35]。然而,在另一项涉及125例血液透析患者的前瞻性研究则认为是骨硬化蛋白而非Dkk1与CVD相关[29]。

小结：近年来,人们一直深入研究CKD患者VC发生与发展的病理生理机制,并试图寻找可靠的血清学生物标志物,这对于早期诊断、早期干预以及改善预后十分重要。但是目前的生物标志物研究均处于临床研究阶段,尚未广泛应用于临床。因此本文梳理了传统的VC标志物(如MGP、PPi、OPG、OC)的诊断价值,同时也分析了新型标志物(如CCP、FGF-23、Klotho蛋白、骨硬化蛋白、Dkk1)的研究结果(表1),为进一步深入研究和未来的临床应用提供了新思路。

表1 慢性肾脏病患者VC生物标志物