利用基因编辑技术提高番茄GABA含量的研究进展

孙星　王文文　卫纯洁　路双　郑志仁　张辉　徐晨曦　汪冲

摘  要： γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然非蛋白质氨基酸，广泛存在于动物、植物、微生物中，并作为信号分子参与体内多种代谢途径和过程.近年研究发现，γ-氨基丁酸能够有效降低高血压患者的血压，且可以通过长时间的饮食摄入起到预防高血压的作用.番茄（）作为全世界产量最多的蔬菜之一，在日常饮食中深受消费者的喜爱.此外，它还是水果和蔬菜中GABA含量最多的作物之一.然而番茄中的GABA主要以游离氨基酸的形式存在，在果实绿熟阶段大量积累，而在果实成熟阶段含量则大大降低.目前，通过杂交育种、诱变育种及基因编辑技术可实现番茄果实成熟阶段GABA含量的增加.该文对近年来在番茄GABA育种中的主要研究进展进行了总结分析，并对基因编辑技术在番茄中的应用现状和前景进行了探讨，对如何通过基因编辑技术更好地提高番茄GABA含量进行了展望.

关键词： γ-氨基丁酸（GABA）; 降血压; 基因编辑

中图分类号： Q 94.337    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2022）01-0087-07

γ-aminobutyric acid （GABA） is a kind of natural non-protein amino acid， which widely exists in animals， plants and microorganisms. GABA participates in various metabolic pathways and processes as signal molecules . Recent studies have found that GABA could effectively reduce blood pressure of patients with hypertension and can prevent hypertension through long-term dietary intake. As one of the most produced vegetables in the world， tomatoe （） is favored by consumers in their daily diet. In addition， it is also one of the crops with the highest GABA content in fruits and vegetables. However， GABA in tomato mainly exists in free amino acids form， which is greatly accumulated at green fruit stage and greatly reduced at fruit ripening stage. At present， the GABA content in tomato fruit at ripening stage has been increased by hybridization breeding， mutagenesis breeding and gene editing. This paper summarized the researches on tomato GABA breeding in recent years， and discussed the application status and prospect of gene editing technology in tomato. We also put forward the prospect of how to proving tomato GABA content by gene editing technology in the future.

γ-aminobutyric acid （GABA）; lower blood pressure; gene editing

0  引 言

生活方式与人体的健康息息相关.不健康的生活方式往往是很多疾病的诱因，如抽烟、酗酒、熬夜、精神压力、久坐不动、高盐饮食等都是引起高血压、高血脂、糖尿病等疾病的病因.据2019年世界卫生组织（WHO）的统计数据，心血管疾病致亡人数约占全球总死亡人数的16%，并自2000年以来逐年上升. 中风则是第二大死亡原因（占世界总死亡人数的11%）.高血压是引起心脏病和中风的一个危险因素. 据《全球高血压流行趋势综合分析研究报告》统计，1990—2020年，30～79岁的高血压成年人人数从6.5亿人增加到12.8亿人.

大量人体内外研究结果表明，γ-氨基丁酸（GABA）是一种具有生物活性和功能的有益化合物，能够有效降低患者的血压.人体内的GABA含量有限，从食物中摄取是补充GABA的重要方式.植物组织中GABA的含量较低，通常在0.3～32.5 μmol∙g之间，不能满足人体的生理需求，番茄（）富含多种维生素、矿物质、番茄红素、胡萝卜素、生物碱等营养元素，同时也是全球高产量，高消耗的经济作物之一，其本身就具有较高的GABA含量.然而使成熟番茄中积累更多的GABA的尝试受阻，传统的杂交育种受种质资源、时间、人力等限制，甚至还会引入一些不利性状.近些年，随着基因编辑技术的问世，植物改良的脚步大大加快.相比于传统的转基因育种，基因编辑技术在靶向修饰特定基因后，又能通过自交或杂交剔除外源基因以消除转基因安全顾虑，因此在番茄和其他作物的育种中具有广泛应用前景.基于番茄果实中GABA含量在果实发育不同时期变化剧烈，从开花到绿熟（MG）期GABA水平增加，成熟期迅速下降的特点，采用CRISPR/Cas9技术介导的单基因、多基因编辑已经成功地使番茄中的GABA含量得以提高.本文重點介绍了番茄中GABA的代谢机制和利用基因编辑技术已经取得的研究进展，并对通过基因编辑技术提高番茄GABA含量的育种工作进行了展望.

1  植物中的GABA

GABA是一种天然非蛋白质氨基酸，分子式为CHNO，广泛存在于动物、植物、微生物中并作为信号分子参与体内多种代谢途径和过程，具有重要的生理学意义（图1）.在人体中GABA是一种抑制性神经递质.有动物实验报道，对患有自发性高血压的大鼠给予外源GABA，能使其血压显著降低.同样有研究证实，通过在饮食中对患有中高度高血压症的病人给予GABA治疗比药物治疗更有助于减轻症状.此外GABA还能起到诱导放松、减轻心理压力、缩短睡眠潜伏期等有益作用.

图1 GABA分子结构图

自1949年科学家首次在马铃薯中检测到GABA，目前几乎所有的重要经济作物和模式作物中均检测到它的存在.GABA在作物中的含量会随物种和品种的不同而出现差异，这取决于许多因素，如植物的发育阶段、生长的环境条件、对生物和非生物胁迫的反应等.很多作物在成熟时都会积累充足的GABA，能够满足人们追求健康生活所需的摄入量（10～20 mg∙d）.

番茄作为全世界生产和消耗最多的作物之一，不仅具有一定的观赏价值，还具有极高的营养价值和经济价值.而且番茄本身含有丰富的GABA和多种营养物质，如维生素C、维生素B、番茄红素、胡萝卜素、生物碱以及多种矿物质元素.番茄中GABA的含量取决于基因型和品种.研究表明野生种番茄GABA的含量明显少于现代栽培种，这可能是对番茄风味的不断选育影响了谷氨酸含量造成的，由此对番茄中增加GABA积累的研究就变得更有意义.

2  番茄中GABA的代谢过程

番茄中的代谢途径

在植物体内GABA的代谢主要是通过GABA分流途径进行的.在番茄细胞质中，谷氨酸在H依赖的谷氨酸脱羧酶（GAD）催化下不可逆地生成GABA，随后在透性酶（GABA-P）的作用下从细胞质进入线粒体中. 在线粒体中，GABA经转氨酶（GABA-T）催化可逆性生成琥珀酸半醛（SSA）.最后，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）催化下生成琥珀酸（Suc），参与三羧酸循环（TCA）代谢，如图2所示.此外SSA还可以被琥珀酸半醛还原酶（SSR）在细胞质中催化成γ-羟基丁酸（GHB）.但是只有从谷氨酸生成琥珀酸的途径才称之为GABA分流.GABA分流被认为在碳、氮初级代谢中发挥着主要作用，是应激和非应激条件下三羧酸循环不可缺少的部分.

图2 GABA代谢图

番茄代谢途径中的主要调节因子

2.2.1 谷氨酸脱羧酶

现阶段已经从不同植物物种中鉴定出很多GAD基因，它们的表达水平受器官类型、生长阶段和环境条件的影响.植物中的GAD是一种典型的吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依赖酶，以六聚体形式存在.与动物和细菌中的GAD不同，植物GAD具有额外的30～50个氨基酸的C末端残基，称为钙调素（CaM）结合域（CaMBD）.体外研究结果表明，植物在Ca和H离子存在的情况下，能通过调节GAD活性来应对各种胁迫.在生理pH值环境下，CaMBD会通过折叠其活性位点来抑制GAD活性，而在酸性pH值（<6.0）和Ca存在的条件下，CaMBD构象发生改变.释放GAD活性位点，使其活性增加.此外，研究表明，CaMBD的去除会导致植物中GABA的积累增加.因此，CaMBD被认为在Ca/CaM存在的情况下（如在应激条件下）激活GAD酶;在Ca/CaM缺失的情况下（如在非应激条件下），CaMBD通过自抑制域发挥作用.

目前在番茄中已经发现了5个GAD基因（Solyc11g011920，Solyc04g025530，Solyc05g054050，Solyc01g005000和Solyc03g098240）.第一个GAD基因，（Solyc03g098240）是研究人员1995年从“Ailsa Craig”番茄果实的cDNA文库中筛选得到的.它在果实绿熟阶段表达量最高，在果实成熟后缓慢降低.之后，科学家陆续从“Micro-Tom”果实发育过程中分离到3个GAD基因：（Solyc03g098240，也称），（Solyc11g011920），（Solyc01 g005000）.的mRNA水平在果实成熟时较高，而和的mRNA水平在果实发育早期最高，随着果实成熟逐渐减少.研究发现，在果实成熟过程中，表达与GABA含量没有明显相关性，而，則参与GABA代谢调控.

2.2.2 γ-氨基丁酸透性酶

GABA-P是一种膜转运蛋白，将细胞质中的GABA转运至线粒体中代谢，将GABA分流途径与三羧酸循环途径联系起来.

2.2.3 γ-氨基丁酸转氨酶

根据底物亲和力不同，有两种转氨酶参与GABA分解代谢，一种为α-酮戊二酸依赖的GABA转氨酶（GABA-TK），另一种为丙酮酸依赖的GABA转氨酶（GABA-TP）.前者以α-酮戊二酸作为氨基受体产生琥珀酸半醛和谷氨酸，后者以丙酮酸或乙醛酸作为氨基受体转化生成丙氨酸或甘氨酸（图2）.研究发现，GABA-TP是植物中特有的，且通常表现出更高的活性，而在其他生物中主要是GABA-TK参与代谢.

番茄中有3个GABA-TP基因参与GABA代谢，分别是线粒体中的-（Solyc07g043310）、细胞质中的-（Solyc12g006470）和质体中的-（Solyc12g006450）.研究证实，-和-参与GABA代谢，且-为调控的主要转氨酶基因.

2.2.4 琥珀酸半醛脱氢酶

SSADH蛋白在大部分生物体中定位在线粒体中.研究表明，SSADH对SSA具有专一性，对控制植物体内整体GABA的水平有重要的作用.

目前在番茄中发现一个SSADH基因（候选基因Solyc09g090700）参与SSA催化生成Suc的过程.其在番茄果实发育各个时期均有表达，但与GABA含量的相关性小.

3  提高番茄中GABA含量的研究进展

番茄中提高含量相关基因的研究

增加番茄GABA含量对促进人体健康有极大的潜能，不仅可以降低轻中度高血压患者的血压，还可以通过长时间饮食摄入起到预防高血压的作用.研究表明，GABA不像其他食品成分，其口感和化学成分不会受其他营养成分影响，且不像糖、盐、脂肪等过量摄入会影响健康.因此很多研究者都尝试了各种办法，试图增加番茄中GABA的含量.

2012年，BEMER等通过番茄果实成熟相关的转录因子和的功能研究发现，在番茄的RNA干扰（RNAi）植株果实中，谷氨酸含量减少到原来的1/8，GABA含量增加2倍.

2013年，KOIKE等通过RNAi技术沉默了3个-的表达，发现-沉默系的GABA含量在果实绿熟阶段增加了近2倍，在果实成熟阶段增加了6.8～9.2倍.而-，-沉默系相对没有明显变化.

2015年，BAO等通过利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）抑制参与GABA代谢的一些关键酶，发现抑制系的GABA含量下降了40%.

2015年，TAKAYAMA等为了探究表达对番茄果实中GABA生物合成的影响，利用RNAi对，和单个基因，以及3个基因同时干扰，发现-系中的GABA水平没有显著改变，而-，-和-全部表現出较低的GABA水平，特别是-对果实GABA水平的影响最大.由此表明，和的表达水平与番茄果实中 GABA的积累有关，而与果实中GABA积累的相关性小，且GABA水平的降低对番茄叶片谷氨酸水平和植株发育影响不大.

为进一步评估对番茄中GABA含量的影响，TAKAYAMA又对基因进行过表达，结果表明：35S启动子过表达完整的，纯合番茄植株在果实绿熟阶段表达增加超过20倍，在果实成熟阶段表达增加超过200倍，与之相应，GABA含量也增加了6～7倍.该研究人员用番茄果实特异性启动子过表达C末端缺少29个氨基酸的，同样使GABA含量增加11～18倍.

介导的基因编辑技术用于提高番茄中含量的研究进展

随着基因编辑技术在动植物中的广泛应用，研究人员也尝试利用CRISPR/Cas9技术提高GABA在番茄中的积累，并取得了预期的效果.同时研究人员也发现番茄中GABA的积累并非越多越好，相反，GABA的过高积累会导致体内氨基酸的严重失衡，引起畸变表型.

2017年，NONAKA等通过比对来自于5种不同植物的10个GAD氨基酸序列，以SlGAD2 C末端第30位、48位氨基酸，以及SlGAD3 C末端的第37位氨基酸为目标，设计了针对GAD自抑制域的3个靶位点（SlGAD2ΔC30，SlGAD2ΔC48和SlGAD3ΔC37）.在没有Ca的环境下，分别在GAD活性最佳pH值（pH=5.8）和植物细胞pH值（pH=7.0）下检测不同C末端自抑制域突变类型对GAD活性的影响.结果表明：突变导致GAD C末端自抑制区蛋白截断后的植株在pH=5.8的条件下，GAD活性分别提高了2.2，2.7和14.6倍;在pH=7.0的条件下，GAD活性分别提高了10.2，16.5和12.9倍.随后检测了番茄叶片和果实成熟阶段GABA的积累，发现GABA含量在叶片中提高了11～12倍，在果实中提高了2～10倍.有趣的是，通过对T代和T代突变类型的分析统计发现，由于突变位点选择的不同，突变类型会有一定的倾向性，且不同突变类型影响GABA的积累，其中SlGAD3ΔC37位点在GAD C自抑制域上游的突变使果实成熟阶段中GABA的积累提高了7～15倍.通过对T代纯合突变植株的大小、开花时间、果实产量等分析发现，大部分植株比野生型略矮，且成熟阶段果实略小.同时，在SlGAD2ΔC30和SlGAD2ΔC48突变株中还会出现开花延迟、没有花芽、结果率降低等不利表型.

2018年，LI等通过对GABA分流途径中的一些关键基因-，-，-，，进行多基因编辑，实现了GABA的高积累，-，-，，的四基因突变体植株与野生型相比，GABA含量在叶片中增加了高达19倍，果实中增加了4倍.然而所有的突变株在生长发育后期也出现了严重的矮化.高GABA含量的突变系中会出现叶片失绿、卷曲、叶片长出次级轴和多个小叶、叶片细胞变得小而皱缩，甚至高度不育等畸形表型.由此可见，有效增加番茄成熟阶段GABA含量的研究任重而道远.

4  展 望

基因编辑技术已经成功应用于植物中，其系统成熟、技术完善，取得了突破性成果，并且，它正以多变、灵活的方式应用于植物品种的改良.其中最有前途的方向之一是应用于顺式调控区，对控制基因转录的非编码序列的编辑.在动植物中进行的大量数量性状位点（QTL）和全基因组关联研究（GWAS）发现，许多驱动进化、驯化和育种的基因变化发生在顺式调控区.与改变蛋白质的编码序列相比，顺式调控区的突变通常具有实质性和多效性，通过修改基因表达的时间、模式或水平引起细微的表型变化.这可能是由于转录控制的复杂性，如启动子和其他调控区域中许多顺式调控元件（CREs）的冗余和模块化组织，且大多数尚不明确.在动植物的进化和驯化过程中，顺式调控变异虽然得到广泛的青睐，但它还远未达到饱和，依然拥有很大的操纵空间.许多研究表明通过顺式调控元件（CREs）突变产生了显著的表型变化.如RODRÍGUEZ-LEAL等通过对控制番茄果实大小，及花序结构基因的顺式调控区编辑，实现了基因的连续突变，得到了一系列突变表型，揭示了顺式调控区影响数量性状的原因.对于花序结构基因，转录变化虽然不能很好地预测其表型效应，但也揭示了调控突变影响数量性状的复杂性.由此可见，靶向其他发育调控因子的启动子或顺式调控区，可以不同程度地改变性状，对进一步的基因研究意义深远.

在利用基因编辑技术增加番茄果实中GABA含量的研究中，已经通过对编码区的突变，如GAD C末端自抑制域的靶向突变、GABA分流途径多个基因的靶向敲除等使得番茄中GABA含量大大提高. 但是GABA在番茄中的高度積累也伴随着畸形表型的出现，如植株矮化、叶片失绿、卷曲、多小叶、开花延迟、花早脱、果实小、坐果率低、育性降低等.为了克服这个现象，有研究人员正在利用基因编辑技术对-顺式元件启动子区域进行靶向突变.通过对-表达的调节，使酶活达到最优水平，实现在不影响植物正常发育的同时最大限度地增加GABA的含量.首先他们设计了一个包含4个gRNAs的载体，作用在-起始密码子上游2 kbp的区域内，将载体转入番茄Micro-Tom.同时，他们还在去除自抑域的GAD自抑制域突变系SlGAD3∆C37起始密码子上游2 kbp区同样设计4个靶向突变点，以此将顺式调控基因表达水平与去除自抑制域的影响结合在一起，有望得到一系列连续数量突变的顺式调节等位基因，从而进一步筛选出既不影响生长发育又富含GABA的理想材料.

研究證明，在植物育种中，基因编辑技术与传统杂交方法相比，效率和精度更高，且可以实现番茄中GABA的含量显著增加.在番茄中还有一些在不改变已知GABA代谢途径的情况下增加GABA含量的现象，说明番茄GABA含量调控途径的复杂性.因此，仍有很大的空间去发掘番茄中参与GABA含量调节的因子.此外，未来在平衡番茄生长发育和GABA的含量方面仍然需要做出很大的努力.

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（责任编辑：顾浩然，郁慧）

收稿日期： 2020-12-04

基金项目： 上海植物种质资源工程技术研究中心项目（17DZ2252700）

作者简介： 孙 星（1996—），女，硕士研究生，主要从事利用基因编辑技术改良番茄品种等方面的研究. E-mail： 465067569@qq.com

* 通信作者： 汪 冲（1988—），女，讲师，主要从事基因编辑在植物中的应用及植物功能基因等方面的研究. E-mail： wangchong0726@163.com

引用格式： 孫星， 王文文， 卫纯洁， 等. 利用基因编辑技术提高番茄GABA含量的研究进展 [J]. 上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（1）：87‒93.

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