改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清涎液化糖链抗原-6和基质金属蛋白酶-7水平的相关性

林佩璜 黄艺君 康 卓 徐 武 吕国荣

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性发展的致死性疾病，其特征是纤维化组织在肺实质内异常积聚，是肺间质疾病最严重的转归，该病的患病率和病死率逐年增加，预后极差［1］。研究［2-3］表明，血清涎液化糖链抗原-6（KL-6）和基质金属蛋白酶-7（MMP7）是评估IPF进展的重要标记物，且血清生物标志物KL-6水平随时间的变化与肺间质疾病的进展和生存率密切相关。本团队前期临床研究［4-5］证实改良肺部超声评分法可用于评估肺间质疾病的严重程度。本实验通过分析改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清KL-6和MMP7水平的相关性，旨在为临床评估肺纤维化提供参考。

材料与方法

一、实验动物及分组

清洁级健康新西兰雄兔33只，体质量3.0～4.0 kg，平均（3.66±0.26）kg，由上海市松江区松联实验动物场提供，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0008，合格证号：20170008002155。将33只新西兰雄兔随机分为实验组（18只）和对照组（15只）。

二、实验方法

1.实验动物模型建立：实验组经3%戊巴比妥（厦门百赛生物科技有限公司，生产批号：AF7012）1 ml/kg麻醉后，使用20 G留置针向足端穿刺环甲膜进入气管，将盐酸博来霉素15 mg（海正辉瑞制药有限公司，生产批号：H20055883）溶解于3 ml生理盐水中，按8 mg/kg的剂量灌注于肺内［6］。对照组依照实验组同样的方法将等量生理盐水灌注于肺内。造模后，分别于第14、21天抽取实验组和对照组各5只兔进行肺部超声检查并于耳缘静脉抽取全血10 ml，最后处死行病理学检查。余实验组兔（8只）在第21天时再次灌注盐酸博来霉素（6 mg/kg），对照组（5只）灌注等量生理盐水，于第42天进行超声检查并于耳缘静脉抽取全血10 ml，然后处死行病理学检查。

2.超声检查：使用日立HIVISION Preirus彩色多普勒超声诊断仪，线阵探头，频率6～15 MHz。待实验兔脱毛后，将胸廓分为左、右两肺区，每侧胸廓第1～3肋间为上部，4～7肋间为下部，共4个肺区（右上、右下、左上、左下），每个肺区沿肋间选取最严重的切面进行横向扫查，观察胸膜线、B线及并发症，并向肺内注射少量亚甲蓝进行标记。上述4个肺区评分相加之和为肺部超声总评分。改良肺部超声评分法由B线数量、胸膜线变化及并发症3个部分组成，见表1。

表1 改良肺部超声评分法

3.兔血清采集及血清KL-6和MMP7水平的测定：将从耳缘静脉抽取的10 ml全血室温静置2 h后，使用台式普通离心机（德国eppendorf公司）3000 r/min离心15 min，取上层血清。采用ELISA法，按照KL-6和MMP7 ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，生产批号分别为20210817-72012A和20210817-72524A）说明书要求，使用SpectraMax 340PC酶标仪（美国Molecular Devices公司）测定KL-6、MMP7水平。

4.肺组织病理学检查：处死实验兔后，取标记处肺组织，常规石蜡包埋、固定、脱水、切片，采用Masson染色。于光学显微镜（CX23，日本Olympus公司）下观察兔肺组织情况。

三、统计学处理

应用SPSS 22.0统计软件，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较行t检验。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间及组内两两比较行非参数秩和检验。相关性分析采用Spearman分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

实验组灌注18只，病理证实均存在肺纤维化，其中第26天死亡1只，第39天死亡2只，最终存活15只（83.3%）。对照组15只均存活。实验组第14天表现为肺泡间隔轻度增厚，肺泡间少量胶原纤维沉积；第21天表现为肺泡间较多胶原纤维沉积；第42天表现为肺泡间大量胶原纤维沉积。对照组第14、21、42天均未出现肺纤维化的病理改变，肺泡间隔无胶原纤维沉积。见图1。

图1 两组兔肺组织病理图（Masson染色，×100）

一、两组兔不同时间点改良肺部超声评分比较

对照组兔肺可探及1～2条B线，未见胸膜及胸膜下改变。实验组兔肺均可探及散在B线、融合B线及胸膜线增厚、不规则、破碎等征象（图2）。与对照组比较，实验组第14、21及42天改良肺部超声评分均明显增加，且两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），于第42天达最高。见表2。

图2 两组兔肺超声表现

二、两组兔不同时间点血清KL-6、MMP7水平比较

与对照组比较，实验组兔血清中KL-6、MMP7水平均明显升高（均P＜0.05）；且随着时间延长而升高，其中，第21、42天兔血清KL-6、MMP7水平与第14天比差异均有统计学意义（均P＜0.05），实验组第42天兔血清MMP7水平与第14、21天比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。与第14天比较，*P＜0.05；与第21天比较，#P＜0.05。KL-6：涎液化糖链抗原-6；MMP7：基质金属蛋白酶-7

表2 两组兔不同时间点改良肺部超声评分及血清KL-6、MMP7水平比较

三、改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清KL-6和MMP7水平的相关性

改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清KL-6、MMP7水平均呈正相关（r=0.844、0.751，均P＜0.05）。见图3，4。

图3 改良肺部超声评分与血清KL-6水平的相关性分析散点图

讨 论

图4 改良肺部超声评分与血清MMP7水平的相关性分析散点图

IPF是最常见的不明原因的间质性肺疾病，预后极差，5年生存率仅20%～40%［7］，因此早期诊断及评估IPF严重程度对其预后至关重要。气管内灌注博来霉素可导致肺泡上皮细胞损伤，诱导炎性细胞浸润及炎性介质释放；在亚急性阶段，病变区域会出现成纤维细胞的增殖和分化，以及促纤维化细胞因子的表达；后期则会出现细胞外基质的大量沉积和纤维化病变［8］。文献［9-10］指出博来霉素单次给药存在可逆性，但通过重复灌注可以解决这一问题［11］，因此本实验在第21天对一组实验兔进行重复灌注。本实验中在各个时间点均对实验兔进行超声检查，若出现B线则表明存在肺间质疾病，证明造模成功，可以进行后续实验。另外，本实验经病理检查结果也证实，气管内灌注博来霉素后肺维化程度随时间延长而加重，于第42天时肺纤维化程度明显增加，证实该建模方法有效。

近年来，肺部超声在IPF影像研究中的应用越来越广泛，但目前关于肺部超声评分系统尚存争议。以往研究［12-13］利用B线数量评价IPF的严重程度，但仅依据B线数量评分并不全面，还应考虑胸膜线及并发症情况。Buda等［14］发现IPF超声征象中除B线及胸膜线之外，还有Am线，其为源于胸膜的广泛垂直伪像，多发平行伪像呈水平排列，延续至屏幕边缘，底部宽，顶部窄。本实验采用团队前期研究［4-5］提出的改良肺部超声评分法，将B线、胸膜线、Am线及胸腔积液纳入该评价系统，且对B线及胸膜线进行了更加细致的分类。本实验结果显示，实验组第14、21及42天改良肺部超声评分均较对照组明显增加（均P＜0.05），且实验组不同时间点两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），随着时间延长兔肺纤维化的程度越来越严重，评分也越来越高，证实改良超声评分法可以评估肺纤维化的严重程度。

尽管目前IPF的发病机制尚无定论，但研究［2-3］证实IPF患者血清中某些血清标记物如KL-6、MMP7水平升高。KL-6通常由肺泡Ⅱ型细胞和呼吸性细支气管上皮细胞产生，在末端支气管上皮的基底细胞中呈弱表达，IPF患者因Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，导致KL-6大量表达，过表达的KL-6通过破坏的肺基底膜进入血清中［15］，导致血清KL-6水平升高。MMP7是MMPs蛋白家族之一，通常在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞和细支气管上皮细胞中表达，可降解多种细胞外基质成分，促进细胞迁移、增殖，在组织重塑及创伤修复中发挥作用［3］。本实验结果表明，与对照组比较，实验组第14、21及42天兔血清KL-6、MMP7水平均明显升高（均P＜0.05），且实验组不同时间点两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。本实验结果还显示，改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清KL-6、MMP7水平均呈正相关（r=0.844、0.751，均P＜0.05），进一步表明改良肺部超声评分法可间接反映肺纤维化的程度。

综上所述，改良肺部超声评分与肺纤维化兔血清KL-6、MMP7水平均呈正相关。由于本实验样本量小，未来需扩大样本量进一步探讨。