铁线莲属植物ISSR分子标记体系优化及指纹图谱的构建

王鑫，郑妍，刘志杰，张存石，刘冬云

(河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000)

铁线莲属(ClematisL. Sp. Pl.)植物约有300余种，花色丰富，花形多变，花期跨度长，可从早春至深秋，花果均具有较高的观赏性和园林应用价值，同时，药用价值高，又具有较强的抗逆性和耐寒性[1-2]。中国铁线莲属植物约147种，其中约98种为我国特有种，主要分布于华中和西南地区。河北省拥有丰富的野生铁线莲属植物资源，其中不乏观赏性状和适应性优良的类型，但目前国内外对铁线莲的研究主要集中在药理化学、无性繁殖、生理抗性等方面，对其种下分类的研究很少[3-6]。长期以来，由于大面积栽培和人工选择，铁线莲种下分类一直比较混乱，现采用ISSR分子标记技术,建立铁线莲属植物ISSR-PCR最佳反应体系,以期为构建铁线莲属植物亲缘关系及遗传图谱奠定基础。

简单重复间序列 (Inter-simple sequence repeat,ISSR) 标记技术具有操作简单、稳定性好和多态性丰富等特点，广泛应用于植物品种鉴定、基因作图与定位、遗传多样性和系统发育等的研究[7]。和文志等建立了铁线莲ISSR-PCR的反应体系，并且进行了反应体系的优化，但只是建立铁线莲园艺品种的最优体系，试验材料不完善，缺乏铁线莲野生种[8]。余伟军、王楠等分别建立了铁线莲属植物的ISSR最优体系，但是在因素选择方面比较单一，都只优化模板DNA、Taq酶、Mg2+和dNTPs 4个单因素[9-10]。对于Master Mix用量、PCR反应循环数等关键因素优化还未见报道。

本试验先通过单因素试验优化选取模板DNA含量、目标引物浓度、Master Mix、循环数等关键因素，然后使用L9(34)正交设计对铁线莲ISSR-PCR反应体系中的各因素进行优化，建立适宜铁线莲野生种的最优ISSR-PCR反应体系，为进一步利用ISSR分子标记进行河北省野生铁线莲遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建等研究提供一定的理论基础[11]。并利用多态性引物构建了遗传指纹图谱，可以对16种野生铁线莲进行有效的区分和鉴定。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为16个类群的野生铁线莲，均采自河北省野外不同地区，引种后种植于河北农业大学试验基地，供试材料见表1。

表1 供试铁线莲信息Table 1 The information of the tested Clematis

1.2 试验方法

采集16种铁线莲新鲜叶片，用70%酒精擦洗叶片表面，放于零下80 ℃冰箱保存。

1.2.1 基因组DNA的提取 本试验DNA的提取采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(CW0531S，康为世纪)，按照试剂盒说明书提取16个铁线莲样本的DNA，母液电泳图条带明亮清晰。以1 μL的ddH2O为空白对照，用Themro微量紫外分光光度计进行DNA纯度检测，其纯度(OD260/OD280)在1.6～2.0之间，说明DNA杂质少，纯度高可用于后续反应。将DNA母液浓度稀释成40 ng/μL的工作液，1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测[12]。

1.2.2 目标引物的确定 从加拿大哥伦比亚大学公布的100条ISSR通用引物中随机挑选20条引物进行初筛，引物序列见表2。

表2 ISSR引物序列信息Table 2 The information of ISSR primer sequence

由表2可知，选取卷萼铁线莲和褐毛铁线莲各2个DNA样本作为模板，选出具有多态性的引物。根据公式:η=1- (1-1/2)n(n为样品数,η为有多态性引物的选中概率)，计算选中的有多态性引物的概率为93.8%。

参考和文志的方法，PCR反应体系为25 μL，12.5 μL的2×Es Taq Master Mix PCR反应液，2 μL模板DNA，2 μL引物，加入超纯水使体系达到25 μL[8]。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，退火(温度取决于引物Tm值)1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反应在BIO-RAD基因扩增仪上进行。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE缓冲液，100 V，0.5 h)检测，6×SuperStain染色，再在紫外透射仪下观察结果，并记录。

1.2.3 ISSR反应体系单因素优化 试验选用1.2.2中初筛出来能扩增出清晰条带的引物U845，ISSR-PCR反应体系中模板DNA含量、目标引物浓度、Master Mix、循环数各设定6个梯度，以单因素优化法进行4组试验，见表3。

表3 ISSR-PCR反应体系的单因素优化Table 3 Single factor optimization of ISSR-PCR reaction system

1.2.4 ISSR-PCR反应体系正交优化 在单因素反应优化的基础上，参考董如何的方法设计L9(34)正交表，对模板DNA含量、目标引物浓度、Master Mix、循环数进行4因素3水平分析(表4)[11]。试验所用引物、Master Mix和2 000 bp DNA marker均购自北京天根生物有限公司。

表4 ISSR-PCR反应体系的正交优化Table 4 Orthogonal optimization for ISSR-PCR reaction system

1.2.5 ISSR-PCR正交反应体系优化结果评价 依照ISSR-PCR扩增条带的数目、亮度、清晰度及特异性分别对9个组合评分，条带多、亮、无杂带拖带的得分最高，为6分，条带少、弱、拖带多的得1分，按照评分结果获得平均分及极差，从而确定最优的各因素的水平及最优体系，并明确各因素对体系的影响大小。

1.2.6 ISSR-PCR反应体系正交优化结果验证 使用优化的铁线莲ISSR-PCR反应体系，利用初筛出来的U834、U840、U844、U899这4条引物，随机对黄花铁线莲、芹叶铁线莲、褐毛铁线莲和钝萼铁线莲4份铁线莲样本进行扩增。

1.2.7 引物筛选及退火温度的优化 严格来说，退火温度并不一定等于其Tm值，而在Tm值附近波动，参考不同引物的Tm值，利用梯度PCR确定该引物的最佳退火温度[13]。以引物U815、U843、U840、U811(Tm=41.9 ℃、41.8 ℃、41.8 ℃、41.9 ℃)为例，设定退火温度梯度分别为45.7 ℃、47.7 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、54.0 ℃、55.4 ℃。以大叶铁线莲DNA为模板，最终确定引物各自的退火温度。

2 结果与分析

2.1 DNA模板浓度优化结果

本试验中，设置6个模板梯度，不同DNA浓度对ISSR-PCR扩增结果，见图1。

注：1～6 DNA浓度分别为10、20、30、40、50、60 ng。

由图1可知，当模板浓度过高或过低时，扩增得到的条带数较少，且个别条带颜色较淡。当模板浓度处于20～40 ng时，扩增的条带清晰且明亮。

2.2 目标引物浓度优化结果

不同引物浓度对PCR反应影响的结果，见图2。

注：1～6引物浓度分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μmol/L。

由图2可知，泳道1条带最暗淡且不清晰，引物浓度在5～ 7 μmol/L之间时，能扩增出较为清楚的条带。当引物浓度大于7 μmol/L时，出现拖尾现象，且引物浓度越大，拖尾越为严重，不便于统计条带。

2.3 Master Mix体系用量优化结果

Master Mix具有稳定性好、灵敏度高、快速简便、特异性强等优点[10]。Master Mix用量 ISSR-PCR反应体系的影响，见图3。

注：1～6 Master Mix用量分别为9、10、11、12、13、14 μL。

由图3可知，随Master Mix加入量增加，扩增条带变亮。当Master Mix加入量小于11 μL时，扩增条带模糊且数量较少。当加入量在12～14 μL时扩增条带变多且稳定清晰。考虑节约成本，12 μL为Master Mix最佳用量。

2.4 ISSR-PCR反应循环数优化结果

PCR反应循环数对扩增影响的结果，见图4。

注：1～6 PCR反应循环数分别为25、30、35、40、45、50。

由图4可知，泳道1和泳道6无扩增条带产生，泳道2条带弥散有拖尾现象。35、40和45个循环数能在PCR反应中扩增出条带，但35和45个循环扩增出的条带过浅和过亮，不能将条带很好的区分开，当PCR循环数为40时，条带清晰且稳定，故PCR反应循环数的最佳值为40个循环。

2.5 ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用1%琼脂糖凝胶电泳检测铁线莲ISSR-PCR正交优化扩增产物，见图5。

图5 ISSR-PCR反应体系的正交优化Figure 5 Orthogonal optimization of ISSR-PCR reaction system

由图5可知，在9组不同组合中，组合1，4，9扩增条带极少且条带较暗；组合6扩增条带弥散不清晰；组合2，3，5，7，8扩增条带清晰且明亮，其中组合2扩增条带效果最好。参照张丽的方法，依据扩增条带的清晰度、亮度、扩增条带的多少等因素进行评分，条带多、亮、无杂带拖带的得分最高，为6分，条带少、弱、拖带多的得1分，3次重复评分结果，见表5、表6、表7。

表5 ISSR-PCR扩增评分结果Table 5 The score results of ISSR-PCR reaction

表6 不同试验因子极差分析表Table 6 Range analysis table for different text factors

表7 ISSR-PCR正交试验方差分析Table 7 Orthogonal test variance analysis of ISSR-PCR

用SPSS 22.0对评分结果进行分析，由方差分析结果可知(表5)，模板DNA和引物浓度对铁线莲ISSR-PCR扩增反应存在显著性影响(P<0.05)。计算各因子在4个试验水平的极差值(R值)。R值越大，说明此因子对ISSR-PCR扩增的影响越大，R值从大到小依次为：引物>模板DNA>Master Mix>循环数(表6)。根据F值可知，各因子浓度水平对ISSR-PCR反应体系体系的影响从大到小依次为：引物>模板DNA>Master Mix>循环数(表7)。因此，正交试验方差分析结果与极差分析结果一致，说明此结果较为可靠。

δ值的大小可以确定对应因素水平组合。由表6可知，δ31>δ11>δ21、δ22>δ31>δ11、δ33>δ13>δ23、δ24>δ34>δ14，因此组合为A3B2C3D2(ABCD表示4个因素，该组合的下标表示该因素所在的水平)得到ISSR-PCR扩增的最优结果。此时反应体系为模板DNA用量40 ng/25 μL，引物浓度6 μmol·L-1，Master Mix用量14 μL/25 μL，循环数40个。

2.6 ISSR-PCR反应体系的验证

使用优化的铁线莲ISSR-PCR反应体系，随机挑选U834、U840、U844、U899这4条引物，对4份铁线莲样本进行扩增，1～4号样本分别为黄花铁线莲、褐毛铁线莲、芹叶铁线莲、钝萼铁线莲。结果见图6。

注：M是DL 2 000 DNA Ladder；1是黄花铁线莲；2是芹叶铁线莲；3是褐毛铁线莲；4是钝萼铁线莲。

由图6可知，不同的引物在不同铁线莲样本中均能扩增出清晰、明亮的条带，且不同种扩增出的条带间，均存在多态性条带。因此，本研究所建立的铁线莲ISSR-PCR反应体系是稳定、可靠的，适用于后续铁线莲的ISSR分析。

2.7 ISSR引物筛选及多态性分析

ISSR引物筛选及多态性分析结果见图7、表8、图8。

图7 引物U815、U843、U840、U811在不同退火梯度下的筛选结果

表8 用于16种铁线莲基因组DNA ISSR-PCR反应的引物信息及多态性分析Table 8 Primers information and polymorphism used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 16 plants of Clematis

图8 引物U824的PCR扩增电泳图谱

铁线莲所用引物参考加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物100条序列(UBC-801～UBC-900)，以铁线莲基因组DNA为模板，部分引物不同退火梯度下筛选结果，见图7。最终筛选出12条能扩增出清晰条带的引物，并确定各自的退火温度。筛选出的12条引物可扩增出104条明亮，无拖带，重复高的谱带。其中共扩增出多态性条带104条，其中特异性条带104条。每个引物平均扩增出8.7个位点，特异性位点为8.7个，多态性百分比为100%(表8)。这12条引物可扩增出6～12条数量不等的条带。扩增条带片段大小为200～2 000 bp。其中，引物U824扩增出的多态性条带最多，为12条(图8)。引物U836和引物U844扩增出的多态性条带数最少，为6条。通过ISSR-PCR扩增体系的12条引物扩增的DNA片段的分子量大部分在200～2 000 bp之间，部分超过2 000 bp。

2.8 16个野生铁线莲的ISSR指纹图谱构建

利用多态性高、条带清晰的ISSR引物UBC815、UBC824和UBC845构建16个野生铁线莲的数字指纹图谱(表9) , 该指纹图谱可以有效地对这些铁线莲野生种进行区分、鉴定[14]。

表9 构建16种野生铁线莲的数字指纹图谱Table 9 Constructed digital fingerprint of 16 Clematis

3 讨论与结论

ISSR分子标记以PCR反应为基础，其扩增效果受反应体系中各个因素的影响，前人先后对金莲花(TrolliuschinensisBunge)、枫香(LiquidambarformosanaHance)、桑树(MorusL.)等园林观赏花卉及树木的ISSR-PCR反应体系进行了优化[15-17]。结果显示，不同作物的最优ISSR-PCR反应体系和适用的引物均不同。经优化后的反应体系能够扩增出多态性丰富且清晰度高的条带。

作为正交试验的基本工具，正交表可以确定因子的主次顺序，利用方差分析对试验数据进行分析各因子对试验指标的影响程度，进而找出优化条件和最优组合来实现试验目的[11]。本研究先用单因素试验确定各影响因子的适宜浓度范围，在此基础上，设计正交试验，以确定适合铁线莲的最优ISSR-PCR反应体系。对于不同的植物材料，ISSR-PCR扩增反应体系所用的DNA模板量、引物浓度、Master Mix用量及扩增反应循环数有所不同，各因子浓度大小及用量的水平变化对ISSR-PCR反应体系影响大小也各不相同。本试验研究结果表明，引物浓度对PCR扩增条带影响最大，DNA模板量和Master Mix用量次之，扩增循环数对PCR扩增条带影响最小。

本试验将ISSR分子标记技术应用于铁线莲上，建立了适用于铁线莲的ISSR-PCR反应体系。结果表明，适用于铁线莲的最优反应体系为模板DNA用量40 ng，引物浓度6 μmol/L，Master Mix用量14 μL，循环数40个。并且利用最优体系构建了16种野生铁线莲的遗传指纹图谱。对于种间区分以及鉴定都有重大意义。

本试验将DNA模板量、引物浓度、反应循环数和Master Mix的用量4种单因素作为体系优化的主体，并且对于4种因素的最佳配比及组合也有了明确的结果，该反应体系的建立为铁线莲遗传多样性研究、DNA指纹图谱建立及分子标记遗传育种研究提供了一定的理论基础。