外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发及幼苗生理特性的影响

宋建超， 杨 航， 景媛媛， 陈彦珠， 鱼小军

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃省草业工程实验室， 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

随着农业和工业的不断发展，污水、废气的排放导致生态环境污染加剧。农业生产过程中，人们单纯的追求作物高产高质，不注重化肥、农药以及灌溉方式等的合理使用，加之气候变化，导致全球盐渍化土壤面积不断增加[1]。草地的不合理利用和过度放牧等也会加剧土壤的盐渍化[2]。据联合国教科文组织和联合国粮食及农业组织的不完全统计，世界范围内盐碱地面积约为9.54亿hm2[3]。中国现有盐渍化土壤面积约为3 693.3万hm2，主要分布在我国东北，华北、西北和滨海地区[3]，严重阻碍了农业生产和发展[4]。渗透胁迫、离子毒害和营养元素失调是盐胁迫对植物造成的主要伤害，严重抑制了植物的生长发育[5-8]。同时盐胁迫还使植物的光合作用和呼吸作用受阻，影响植物的吸水性，阻碍植物根系对必需营养元素的汲取，最终导致作物减产[9-10]。土壤盐渍化已然成为威胁农业以及生态环境的世界性问题。

垂穗披碱草(Elymusnutans)为禾本科披碱草属多年生丛生植物，具有抗旱、耐碱、营养品质好、适口性好、耐放牧等特性[11-12]，是青藏高原优良的牧草品种之一[13-14]。垂穗披碱草凭借较强的繁殖能力、对临时生境的高度适应性，在退化草地的改良和人工草地的建设中扮演着重要角色，是高寒地区草地恢复、生态修复和建植人工草地的首选草种[15]。但是，土壤盐渍化抑制了垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长，导致幼苗生长缓慢、死亡[16]，从而阻碍了退化草地的修复和人工草地的建植。

目前植物生长调节剂被广泛应用于缓解植物对逆境的抗性研究中[17]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是普遍存在于生物体内的一类四碳非蛋白质氨基酸[18]，是植物细胞自由氨基酸库中的重要组分，调控植物体内碳、氮两大代谢途径，可通过调节碳氮平衡和胞质pH、促进氨基酸和碳水化合物代谢、诱导激素合成(乙烯)等，参与植物生长发育调控，提高植物的适应性和抵御非生物胁迫、病虫害的能力[19]。GABA在植物体内作为一种信号分子，与植物激素相互协调发挥作用，在逆境胁迫下GABA能够发挥渗透调节、抗氧化保护以及清除活性氧的功能[20]。研究表明，植物在适宜生长条件下体内GABA含量低，当受到外界胁迫时，植物体内GABA含量会迅速增加，表明GABA可能在抵御非生物胁迫中发挥着重要作用[21]。已有报道指出，通过GABA浸种能够促进小麦(Triticumaestivum)幼苗的生长，并且在0.5 mmol·L-1GABA处理下小麦发芽率和鲜重明显提高，可以减轻盐胁迫对小麦幼苗造成的伤害[22]。田小磊等[23]的研究表明，盐胁迫严重抑制了玉米(Zeamays)种子的萌发，添加外源GABA可显著提高玉米种子的发芽率，并且能够提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性，来缓解盐胁迫对玉米幼苗的伤害。

然而，不同植物对外源GABA的响应存在差异，并且有关其调节垂穗披碱草种子萌发过程中耐盐性和耐盐机制的研究较少。因此，本试验研究100 mmol·L-1NaCl胁迫下，施加不同浓度的外源GABA对垂穗披碱草种子萌发和幼苗生理特性的影响，旨在探究外源GABA提高垂穗披碱草耐盐性的生理机制，以期为垂穗披碱草抗逆性研究奠定理论基础，并为其耐盐性栽培管理以及退化草地修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试种子为垂穗披碱草种子，产地位于青海省，于2020年9月下旬收获，带回实验室并保存于4℃低温种子库中，初始发芽率约为90%。本试验于2021年7月在甘肃农业大学草业学院实验室进行。

GABA购买上海麦克林生化科技有限公司，纯度≥99%，可配制成含10 mmol·L-1GABA的100 mmol·L-1NaCl母液备用，使用前稀释为相应浓度的处理液。

1.2 材料处理

从供试垂穗披碱草种子中，挑选大小均一且无霉变和破损的种子，用75%的乙醇溶液消毒1 min，用蒸馏水反复冲洗7～9次，将残余乙醇冲洗干净，最后用滤纸吸干种子表面水分备用。

1.3 试验设计

本试验采用100 mmol·L-1NaCl溶液作为盐胁迫处理，此时的胁迫程度为中度盐胁迫[16]。挑选经消毒处理过的垂穗披碱草种子50粒，置于双层滤纸的9 cm一次性培养皿中，加入配置好的含GABA的NaCl溶液。本研究共设置8个处理分别为(表1)：CK1(对照(蒸馏水))，CK2(100 mmol·L-1NaCl溶液，G1(100 mmol·L-1NaCl + 0.05 mmol·L-1GABA)，G2(100 mmol·L-1NaCl+0.10 mmol·L-1GABA)，G3(100 mmol·L-1NaCl+0.25 mmol·L-1GABA)，G4(100 mmol·L-1NaCl+0.50 mmol·L-1GABA)，G5(100 mmol·L-1NaCl+1.00 mmol·L-1GABA)，G6(100 mmol·L-1NaCl+2.00 mmol·L-1GABA)，每个处理设3次重复。将培养皿置于光照培养箱内进行发芽试验，萌发条件为光照14 h/25℃，黑暗10 h/15℃，光照强度为6 000 lx[24]。在固定时间进行称重补充散失的水分以保持盐溶液浓度，每天观察并记录当日发芽数，胚芽长度达到种子长度1/2为发芽标准，并连续记录12 d。试验第5 d计算发芽势，发芽试验结束后统计发芽指标以及幼苗根长和苗长，并且进行幼苗生理指标的测定。

表1 试验各处理溶液浓度Table 1 The solution concentration of each treatment in the experiment

1.4 测定指标与方法

1.4.1发芽指标的测定 种子萌发相关指标发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数等测定和计算公式如下[25]：

发芽势(Germinating energy,GE，%)=(发芽试验前5 d的正常发芽种子数/供试种子数)×100%

发芽率(Germination percenage，G，%)=(发芽终期12 d内的正常发芽种子数/供试种子数)×100%

发芽指数(Germination inde,GI)=∑(Gt/Dt)

式中Gt为第t天相应的发芽数，Dt为相应的发芽天数。

活力指数(Vigor index，VI)=GI×S

式中S为幼苗平均长度，GI为发芽指数。

1.4.2生长指标的测定 苗长和根长：发芽试验结束后，在各处理培养皿中随机选取10株幼苗，用直尺(0.1 cm)测量幼苗苗长和根长。

1.4.3幼苗生理指标的测定 可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量采用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，脯氨酸(Proline,Pro)含量采用磺基水杨酸法测定，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[26]。POD活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用紫外吸收法测定，SOD活性采用氮蓝四唑(Nitro-blue tetrazolium，NBT)法测定[27]。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2019处理数据和制图，用SPSS 26.0软件进行单因素方差(ANOVA)分析，并用Duncan法进行多重比较，差异显著性均采用P<0.05表示，各指标数据均为3个重复的“平均值±标准误”表示。

利用主成分分析将外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长的相关指标降维,筛选出耐盐性综合指标，并计算出综合指标权重，最后采用隶属函数进行外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长缓解效应的综合评价。以上参考王苗苗等[28]的方法，计算方法如下：

(1)各处理综合指标隶属函数值：

(1)

Xj表示第j个综合指标；Xjmin表示第j个综合指标最小值；Xjmax表示第j个综合指标最大值。

(2)各处理综合指标权重：

(2)

wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Pj表示第j个综合指标的贡献率。

(3)各处理缓解效应综合评价：

(3)

D值为外源GABA在NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长的缓解效应综合评价值，其值越高说明在该浓度处理下外源GABA对NaCl胁迫的缓解效应越好。

2 结果与分析

2.1 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发及幼苗生长的影响

与CK1(蒸馏水)相比，NaCl胁迫(100 mmol·L-1)显著抑制了垂穗披碱草的萌发,降低了其苗长和根长，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能够明显促进垂穗披碱草种子的萌发和生长(表2)。NaCl胁迫(CK2)处理下，垂穗披碱草种子的萌发指标均显著低于蒸馏水对照(CK1)处理(P<0.05)。NaCl胁迫处理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA可提高垂穗披碱草种子的发芽势和发芽率，且不同浓度处理间存在差异。与CK2相比，G4(0.5 mmol·L-1)处理下垂穗披碱草的发芽势和发芽率分别提高了130.43%和26.87%。在NaCl胁迫处理下，添加外源GABA显著提高了垂穗披碱草种子的发芽指数和活力指数(P<0.05)，且不同浓度处理间存在差异。与CK2相比，在G4(0.5 mmol·L-1)处理下垂穗披碱草的发芽指数和活力指数分别提高了82.11%和224.00%。

盐胁迫显著抑制了垂穗披碱草幼苗的生长(表2)，与CK1相比，其苗长和根长显著降低(P<0.05)。NaCl胁迫处理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA显著提高了垂穗披碱草幼苗的苗长和根长(P<0.05)，且不同浓度处理之间存在差异，与CK2相比，G4处理下垂穗披碱草的苗长和根长分别提高了77.98%和107.34%。

表2 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发及幼苗生长的影响Table 2 Effects of exogenous GABA on seed germination and seedling growth of Elymus nutans under NaCl stress

2.2 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发过程中渗透调节物质和MDA含量的影响

与CK1(蒸馏水)相比，100 mmol·L-1盐胁迫显著提高了垂穗披碱草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)(图1)。在盐胁迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA提高了垂穗披碱草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)，可溶性糖含量则呈现“先降后升”的变化趋势。并且不同浓度GABA处理间存在差异，其中可溶性糖含量在G5和G6处理下最高，高溶性蛋白含量在G4和G5处理下最高，脯氨酸含量在G5处理下最高，分别较CK2处理提高了16.71%和22.48%，75.54%和61.58%，36.35%。

如图1D所示，与CK1处理相比，100 mmol·L-1盐胁迫显著提高了垂穗披碱草幼苗丙二醛含量(P<0.05)。在盐胁迫下，外源添加0.05～2 mmol·L-1GABA能够显著降低丙二醛含量，并且不同浓度处理均与CK2差异显著(P<0.05)。其中，在G4和G5处理下丙二醛降低效果最好，分别较CK2处理降低了53.72%和49.41%。

图1 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草幼苗可溶性糖(A)、可溶性蛋白(B)、脯氨酸(C)和MDA(D)含量的影响Fig.1 Effect of exogenous GABA on the contents of soluble sugar (A),soluble protein (B),proline (C) and MDA (D) in Elymus nutans seedlings under NaCl stress注：不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)，下图同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between each treatment at the 0.05 level,the same as below

2.3 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草幼苗体内抗氧化酶活性的影响

由图2可知，与CK1(蒸馏水)相比，100 mmol·L-1盐胁迫和盐胁迫下不同浓度的GABA处理显著增加了幼苗POD，CAT和SOD活性(P<0.05)。盐胁迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能显著提高垂穗披碱草幼苗抗氧化酶POD，CAT和SOD活性(P<0.05)，且在不同浓度GABA处理间存在差异，其中G5处理对POD活性的促进效果最佳，G4处理对CAT和SOD活性的促进效果最佳，三种酶活性分别较CK2处理提高了97.27%，56.19%和31.91%。

图2 外源GABA对NaCl胁迫下垂穗披碱草幼苗SOD(A)，CAT(B)，POD(C)活性的影响Fig.2 Effects of exogenous GABA on SOD (A),CAT (B) and POD (C) activities of Elymus nutans seedlings under NaCl stress

2.4 综合评价

采用主成分分析法，将NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发参数、幼苗生长和幼苗渗透调节物质、抗氧化系统等指标分为了2个主成分(表2)。其中第1主成分各指标系数较大的是发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、苗长和根长，特征值为6.936，贡献率为53.351%。第2主成分各指标系数较大的是可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD，CAT，SOD活性，特征值为5.392，贡献率为41.473%，二者累计贡献率达到了94.825%。

利用隶属函数法对外源GABA对NaCl胁迫缓解效应进行综合评价(表3)得出，添加外源GABA在G2至G6处理对NaCl胁迫的缓解效果明显。在G4(0.5 mmol·L-1)处理下，外源GABA对垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长缓解NaCl胁迫的效果最佳。综合评价结果为：G4>G5>G3>G6>G2>CK1>G1>CK2。

表3 各综合指标系数及贡献率Table 3 Coefficient and contribution rate of each comprehensive index

续表3

表4 不同处理各综合指标值、权重、隶属函数值、D值及盐胁迫缓解效应评价Table 4 The comprehensive index values,index weight,membership function value,D values and mitigation effect evaluation of salt stress under different treatments

3 讨论

盐胁迫是影响植物种子萌发和幼苗生长的主要非生物胁迫。种子萌发是植物开始个体发育第一阶段的复杂生理过程，是影响植物生命周期的关键环节[17]。种子的发芽率、发芽势、发芽指数反映了种子的发芽速率，活力指数则说明了种子能否迅速发芽和生长的整齐程度[29]。本研究表明，在100 mmol·L-1的NaCl胁迫处理下显著抑制了垂穗披碱草种子的萌发和生长。原因可能是100 mmol·L-1NaCl处理损坏了细胞质膜，增大了细胞膜通透性，导致细胞内液外流，打破胞内离子平衡，影响了垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长，这与前人的研究结果一致[17]。有研究表明，种子萌发过程中氨基酸代谢发生改变，激活包括谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)等多种关键酶，参与种子的萌发过程，而GABA作为谷氨酸脱羧酶的产物，在植物种子萌发期间发挥着重要作用[18]。并且在种子萌发期间，GAD催化谷氨酸脱去羧基生成的GABA，经GABA-T催化GABA生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde，SSA)，随后被催化生成琥珀酸，参与三羧酸(Tricarboxylic-acid，TCA)循环或直接进入呼吸链氧化，为抵抗胁迫反应提供能量[30-32]。本研究结果表明，在NaCl胁迫下，添加外源GABA可显著促进垂穗披碱草种子萌发和幼苗的生长，且在0.5 mmol·L-1GABA处理下的效果最优。赵嫚等[19]研究发现，外源施用0.5～2.0 μmol·L-1GABA促进了盐胁迫下金花菜(Medicagopolymorpha)种子萌发和幼苗的生长，这与本研究结果类似。研究表明，添加外源GABA增加了玉米幼苗在高盐胁迫下内源GABA的浓度，使幼苗的耐盐性增强[33]。也有报道指出，外源GABA可诱导植物体内乙烯的合成，而乙烯对促进种子萌发具有重要作用[34]。说明，施用外源GABA可提高植物内源GABA含量，诱导乙烯的合成，并为植物抵抗外界胁迫提供能量，从而促进种子的萌发和幼苗的生长发育。

渗透调节物质是植物体内应对逆境胁迫诱导积累的重要信号物质，在植物种子萌发的过程中起到关键作用[35]。在盐胁迫下，植物体内产生渗透胁迫，不得不积累更多的渗透调节物质来缓解盐胁迫引发的渗透胁迫。本研究结果表明，在100 mmol·L-1NaCl胁迫处理下，垂穗披碱草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量较CK1(蒸馏水)显著增加，来调节渗透平衡，从而缓解盐胁迫。在盐胁迫下，添加外源GABA显著增加了垂穗披碱草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量，可溶性糖含量呈“先降后升”趋势。研究表明，施用外源GABA增加了盐胁迫下甜高粱(Sorghumdochna)幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量，缓解了其所受的盐胁迫，这与本研究结果类似[36]。王骁[37]的研究结果表明，在高浓度盐胁迫下添加外源GABA后西伯利亚白刺(Nitrariasibirica)幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量呈“先升后降”趋势。以上研究均说明，盐胁迫下植物通过提高自身渗透调节物质来缓解盐胁迫，添加外源GABA可促使植物幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等渗透调节物质积累增多，一方面为种子萌发不断提供能量和营养物质，另一方面有助于有害物质的中和，提高植物的耐盐性。

4 结论

NaCl胁迫抑制了垂穗披碱草种子的萌发和幼苗的生长，外源GABA处理可促进NaCl胁迫下垂穗披碱草种子的萌发和幼苗的生长。在NaCl(100 mmol·L-1)胁迫下，外源施用0.05～2.00 mmol·L-1GABA促进了垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长，并且增加了萌发过程中幼苗渗透调节物质含量，降低MDA含量，提高抗氧化酶活性，改善了垂穗披碱草种子萌发过程中的耐盐性。利用隶属函数综合评价得出：0.5 mmol·L-1外源GABA处理对促进NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长效果最佳。建议可通过包衣或浸种0.5 mmol·L-1GABA提高NaCl胁迫下垂穗披碱草种子的出苗率，并促进幼苗生长。