玫瑰花HPLC 指纹图谱及质量评价研究

符映均，姜晓燕，张 硕，彭 敏，张 莉，徐 容，杨 楠，张欣怡

（1.南通市中医院 药剂科，江苏 南通 226000；2.江苏省食品药品监督检验研究院 中药和保健食品化妆品检验室，江苏 南京 210019；3.南通卫生高等职业技术学校 药学系，江苏 南通 226000；4.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023）

玫瑰花首载于《食物本草》，现全国各地基本都有栽培，其中以山东、甘肃等地最多[1]。2020 年版《中国药典》（一部）规定玫瑰花应为蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，味甘、微苦，具有行气解郁、和血、止痛的功效，临床上一般用于治疗肝胃气痛、食少呕恶、月经不调等症[2]。

玫瑰花中黄酮类成分种类多，又易与糖类形成黄酮苷而广泛存在，且标准品难获取，除高分辨分析质谱外其它分析手段难以获得更全面的信息，而通过黄酮苷酸水解之后进行检测，能更全面地反应各苷元代表的黄酮类化合物信息[3-5]。目前，关于玫瑰花质量评价分析的研究主要集中在单一成分的含量测定或醇提物的指纹图谱报道，但对玫瑰花酸水解提取物的质量评价分析却未见报道[6-9]。本研究通过建立不同产地玫瑰花酸水解提取物的HPLC 指纹图谱，考察不同产地玫瑰花中的质量差异，旨在为玫瑰花的质量评价及控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国赛默飞科技有限公司）；MS105D 型十万分之一电子天平（德国梅特勒-托利多有限公司）等。

1.2 试剂与试药

没食子酸（批号：110831-201605，纯度：90.8%）、槲皮素（批号：100081-201610，纯度：99.1%）、鞣花酸（批号：111959-201903，纯度：88.8%）均购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸（批号：AF6121206，纯度：98%）、原花青素B2（批号：AF20051602，纯度：98%）均购自成都埃法生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。30 批玫瑰花药材均为市售，并经南通市中医院明戈主任中药师鉴定为正品，详细信息见表1。

表1 30 批玫瑰花样品信息Tab. 1 Sample information of Rosae Rugosae Flos

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定各对照品适量，加80%甲醇配制成含没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素浓度分别为0.054、0.007、0.137、0.151、0.010 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定玫瑰花粉末（过三号筛）0.5 g 并精密加入80%甲醇40 mL，称重，回流1 h，放冷，用80%甲醇补足失重，过滤，精密移取续滤液25mL，精密加入5 mL 盐酸，称重，水解40 min，放冷，用80%甲醇补足失重，过0.22 μm滤膜，即得。

2.2 色谱条件

THERMO AcclaimTM 120 C18色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0 ～ 10 min，3%B；11 ～31 min，10%B；32 ～ 42 min，16%B；43 ～ 63 min，19%B；64 ～ 80 min，30%B）；流速为1.0 mL/min；检测波长为270 nm；柱温为35 ℃；进样体积为10 μL。

2.3 玫瑰花指纹图谱的建立及方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一批玫瑰花供试品溶液，按“2.2”项下条件连续测定6 次。以峰12（鞣花酸）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD ＜0.32%，相对峰面积的RSD ＜1.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批玫瑰花样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份，按“2.2”项下条件分析，以峰12（鞣花酸）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD ＜0.72%，相对峰面积的RSD ＜2.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一批玫瑰花供试品溶液，按“2.2”项下条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析。以峰12（鞣花酸）为参照峰，显示各共有峰相对保留时间的RSD ＜0.65%，相对峰面积的RSD ＜1.9%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.4 共有模式的建立及相似度评价 取30 批玫瑰花（S1 ～ S30），按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下条件分析，得到HPLC 图谱。相关数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，以S1 为参照图谱，多点校正，采用中位数法，时间宽度为0.1 min，进行Mark 峰匹配，生成指纹图谱，见图1。

鞣花酸作为玫瑰花的成分之一，是发挥药理作用的主要活性成分。该成分在HPLC 色谱图中分离度好、容易辨认，故本实验选鞣花酸（峰12）作为参照峰。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成对照图谱并计算相似度，经匹配后，共确定20个共有峰，不同批次的玫瑰花色谱峰基本相似，S1 ～S30 的相似度为0.957 ～ 0.999，表明各批次之间的质量较接近。结果见表2。

图 1 30 批玫瑰花样品指纹图谱和对照指纹图谱Fig. 1 Fingerprints of 30 batches of Rosae Rugosae Flos

表2 30 批玫瑰花指纹图谱之间的相似度结果Tab. 2 Similarity among the 30 batches of samples

2.4 化学计量分析

2.4.1 聚类分析（CA） 以玫瑰花中20 个共有峰的峰面积为变量，采用SPSS 26.0 软件对30 批样品进行聚类分析，并进一步使用GraphPad Prism 8 对其进行统计分析，得到箱型分布图，结果见图2、图3。

2.4.2 主成分分析（PCA） 以30 批样品的20 个共有峰的峰面积导入SPSS 26.0 进行主成分分析，提取特征值＞1 的成分为主成分，最终提取出4 个主成分，累积方差贡献率为83.502%，结果见表3、表4。根据表4 得知，峰2、峰5、峰7、峰9（原花青素B2）、峰10、峰11、峰13 ～峰16、峰18、峰19（槲皮素）在主成分1 上有较高载荷；峰1（没食子酸）、峰6、峰10、峰17 在主成分2 上有较高载荷；峰4 （原儿茶酸）、峰5、峰8 在主成分3 上有较高载荷；峰12（鞣花酸）在主成分4 上有较高载荷。

表3 主成分的初始特征值和贡献率Tab. 3 Principal component analysis of eigenvalue and variance contribution rate of samples

表4 因子载荷矩阵Tab. 4 Factor loading matrix of samples

2.4.3 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

赋权涉及到个人、人际、微观的环境与组织以及宏观的环境或社会政治等四个层次。①个人层面：发展个人权力感与自我效能感；②人际层面：强调个人与他人面对共同的问题，并合作解决问题的经验；③微观环境与组织层面：强调服务的输送，是确保资源和改变的中间层次系统；④宏观环境或社会政治层面的赋权：强调通过社会行动、政治系统或社会政策来进行社会改变。

为明确20 个特征峰中对样品分类贡献和影响较大的成分，将30 批样品的20 个特征峰峰面积导入SIMCA 14.1 绘制PCA 得分图、PLS-DA 得分图、30批玫瑰花中各成分的VIP 值图，结果见图4-7。从图4 得知，样品数据均落在95%置信区间内，表明各批次样品成分相对稳定；从PCA 得分图可以看出，S1 ～S30 分离显著，仅与聚类Ⅰ相似，而PLS-DA 与PCA的结果基本相同，表明不同地区和批次的玫瑰花化学成分存在差异。从图6 得知，20 个共有峰对样品分布情况的贡献不同，其中峰3、峰8、峰12（鞣花酸）、峰16、峰19（槲皮素）距离中心点较远，表明其对玫瑰花的质量影响较大。色谱峰的VIP 值越大，贡献越大，当VIP ＞1，表明该峰对样品的影响有统计意义。按各色谱峰对玫瑰花分类影响的大小进行排序，根据VIP 值大小依次为：峰12（鞣花酸）、峰16、峰19（槲皮素）、峰8、峰3、峰6，与PCA 分析结果较为一致，可将其作为质量控制的关键成分。

图 2 30 批玫瑰花聚类分析结果Fig. 2 Cluster analysis of 30 batches of samples

2.5 玫瑰花中5 种成分的含量测定

2.5.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、玫瑰花供试品溶液和空白溶液10 μL，按“2.2”项下条件分析，结果见图8。

图 3 玫瑰花中20 个共有峰峰面积的箱型图Fig. 3 Box plots of the 20 detected compounds in Rosae Rugosae Flos

图 4 30 批玫瑰花主成分得分图Fig. 4 PCA score chart of 30 batches of samples

图 5 30 批玫瑰花样品PLS-DA 得分图Fig. 5 PLS-DA score chart of 30 batches of samples

图 6 30 批玫瑰花样品主成分载荷图Fig. 6 Load diagram of 30 batches of samples

图 7 30 批玫瑰花样品中活性成分的VIP 值Fig. 7 VIP of samples difference markers in 30 batches of samples

图 8 玫瑰花供试品（a）、混合对照品（b）和空白溶液（c）色谱图Fig. 8 HPLC chromatograms of test solution（a），mixed reference substance solution（b）and negative solution（c）

2.5.2 线性关系考察 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，分别进样2、5、10、15、20、25 μL，按“2.2”项下条件分析。以进样量为横坐标（X，μg）、峰面积为纵坐标（Y），绘制线性回归方程。结果显示5个成分在相应浓度范围内线性关系良好，见表5。

表5 5 个指标成分线性回归方程Tab. 5 Linear relationship of each component

2.5.3 精密度试验 精密吸取同一浓度的混合对照品溶液10 μL，按“2.2”项下条件分析，连续进样6 次。没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素峰面积的RSD 分别为1.08%、1.01%、0.99%、1.05%和1.09%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 精密称取同一批玫瑰花样品6份，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下条件分析，计算含量。结果没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素的平均含量分别为6.40 mg/g、0.76 mg/g、9.04 mg/g、19.32 mg/g、0.43 mg/g，RSD 分别为1.98%、2.28%、0.85%、1.98%和1.73%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一份玫瑰花供试品溶液，按“2.2”项下条件在0、2、4、6、8、12、24 h 测定。结果没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素的峰面积RSD 分别为2.06%、1.99%、5.52%、1.52%和2.84%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5.7 样品测定 取30 批玫瑰花样品，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下条件分析测定，计算样品含量，见表6。

表6 30 批玫瑰花中5 个成分的含量测定结果（mg/g，n = 2）Tab. 6 Determination results of 5 components in the 30 batches of Rosae Rugosae Flos（mg/g，n = 2）

3 讨论

3.1 色谱条件的考察

本实验分别考察210、270、330 和365 nm 波长下各指标成分含量差异，综合评定选取270 nm 作为本试验的检测波长；试验过程中分别比较了水-甲醇不同比例、不同浓度磷酸水溶液-乙腈和不同浓度磷酸二氢钾溶液-乙腈作为流动相的分离效果，结果表明选用0.2%磷酸-乙腈作为流动相能保证供试品溶液各成分的最大响应。

3.2 提取条件的选择

该实验采用正交设计L9（34）优选玫瑰花中没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素的最佳提取工艺，考察因素包括甲醇用量（30、40、50 mL）、盐酸用量（3、4、5 mL）、酸解时间（30、40、50 min）。经过直观分析和方差分析，最终确定玫瑰花样品的提取条件为0.5 g 药材加80%甲醇40 mL，称重，回流1 h，放冷，过滤，取25 mL 续滤液，加5 mL 盐酸，水解40 min。

3.3 结果分析

从指纹图谱的分析中可以看出，30 批玫瑰花的酸水解提取物在化学成分上较为一致，但其中某些成分的含量存在一定差异。在5 个定量成分中，除没食子酸、原花青素B2、鞣花酸外，原儿茶酸和槲皮素的含量相对偏低，且原花青素B2的含量差异最大，这可能与该成分不稳定、药材的来源和产地、药材储存等因素有关。根据VIP 分析得知，峰12（鞣花酸）、峰16、峰19（槲皮素）、峰8、峰3、峰6 对样品分析起重要作用，受限于试验条件，峰16、峰8、峰3和峰6 还需通过LC-MS、NMR 等技术手段进行求证。

通过对30 批玫瑰花样品的聚类分析得知，其中S8 ～ S12、S14、S15、S17 ～ S24、S30 归为一类；S1 ～S4、S6、S13、S16、S25 ～ S29 归为一类；S5、S7 归为一类。通过20 个共有峰的箱型图可以发现，聚类为第Ⅰ类的样品各成分含量差异较大。峰9（原花青素B2）在类别Ⅱ中的含量显著低于类别Ⅰ和Ⅲ，多有文献报道原花青素B2是玫瑰花中主要的活性成分，被广泛的用于药品及食品行业，其药理作用包含抗炎、免疫调节、调节免疫、心血管保护等[10-11]。聚类为第Ⅰ类的峰1（没食子酸）、峰4（原儿茶酸）的含量要高于类别Ⅱ和Ⅲ；鞣花酸和槲皮素两种成分在肝癌等癌症及抗炎和抗氧化等方面体现出较大的优势，聚类为第Ⅱ类的峰9（原花青素B2）、峰12（鞣花酸）、峰19（槲皮素）的含量要高于Ⅰ和Ⅲ，表明类别Ⅰ的玫瑰花中含有的有机酚酸类成分较多，类别Ⅱ的玫瑰花中黄酮类成分较多，提示可能具有更多的开发利用价值。

4 结论

本研究建立了30 批不同产地玫瑰花酸水解产物的指纹图谱，确定了20 个共有峰，同时又对玫瑰花中没食子酸、原儿茶酸、原花青素B2、鞣花酸和槲皮素5 个成分定量分析，方法学考察结果良好。实验方法简单、准确、可靠，可用于玫瑰花质量的定性和定量评价。虽然本实验所用的玫瑰花均来源于市售和药材市场，但是根据聚类分析和主成分分析等结果，30 批样品的产地之间未呈现独立的相关性，提示可能20 个共有峰与产地之间可能无直接相关性，对于产地的识别还有待进一步验证和完善。