钼污染对丛枝菌根和球囊霉素的影响

尹可敬，曹利兵，徐晓峰，石兆勇，2，3，4*

（1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023；2.中国科学院成都山地所山地表生过程与生态调控重点实验室，四川 成都 610041；3.洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室，河南 洛阳 471000；4.洛阳市植物营养与环境生态重点实验室，河南 洛阳 471023）

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在自然界中分布广泛，除大量分布于农田和森林土壤中外，在一些逆境环境，如沙漠、河流滩涂、盐碱及各类矿区土壤中也均存在［1-3］。研究表明，丛枝菌根具有改善土壤结构、增加土壤肥力、提高土壤生物活性的功能［4-7］。同时，丛枝菌根真菌通过与植物形成共生关系，还能促进植物对水分和矿质养分的吸收，增强植物对不良环境的适应能力等［8-9］。球囊霉素是丛枝菌根真菌分泌的一种专性蛋白，也广泛分布于陆地生态系统［10-11］。已有研究表明，球囊霉素难溶于水，不易被蛋白酶水解，在土壤中的性质极为稳定，随着菌丝及孢子的分解而缓慢释放到土壤中，成为土壤有机碳库的重要来源［12］，同时球囊霉素还具有改善土壤结构、降低重金属对植物毒害的作用［12］。

矿山的开采、选矿、重金属尾矿、冶炼废渣等，都会造成土壤重金属污染［13］。土壤重金属污染不仅对植物产生毒害作用，抑制作物的生长［14］，同时土壤重金属污染对丛枝菌根真菌与植物共生关系的形成、丛枝菌根真菌的繁殖及分泌球囊霉素的能力都有着不容忽视的影响［15-17］。丛枝菌根真菌能否侵染植物是丛枝菌根真菌与植物能否形成共生关系的基础，菌根侵染频度（F）是植物与丛枝菌根真菌之间共生关系的直接体现，菌根侵染率是丛枝菌根真菌侵染频度和侵染强度的综合反映［18］。孢子密度（Spores density）则体现了丛枝菌根真菌的繁殖能力［19］。吴春华等［20］研究发现，相同试验处理下，添加铅能使苦荬菜、早熟禾、黑麦草等植物的菌根侵染率出现显著下降，而无芒稗、车前草、酢浆草的菌根侵染率则出现显著上升的情况。肖艳萍等［18］研究发现，丛枝菌根真菌广泛分布于重金属污染的铅锌矿区土壤中。班宜辉等［16］通过对铅硐山铅锌矿区丛枝菌根真菌侵染特征的研究发现，一定程度重金属胁迫能促进丛枝菌根真菌与植物共生关系的建立，而浓度过高的重金属胁迫会抑制丛枝菌根真菌侵染，同时丛枝菌根真菌的孢子密度与侵染率间没有显著相关性。孔凡美等［21］研究发现，在复合重金属污染的土壤中菌根侵染率有较高的水平，丛枝菌根真菌的孢子密度随重金属污染程度的加深而锐减。同时研究还发现，重金属对丛枝菌根真菌分泌球囊霉素也有一定影响［22-23］。张旭红等［22］在添加0～600 mg·kg-1外源铅的旱稻盆栽试验中发现，随着铅含量的增加，球囊霉素含量显著降低。卓逢等［23］在接种丛枝菌根真菌的玉米盆栽试验中也发现，高浓度的铅、镉会显著降低土壤中球囊霉素的含量。

钼是一种十分重要的矿产资源，我国目前探明的钼金属矿有300多处，钼储量约为850万t［24］。河南省钼储量占全国总储量的30.0%以上，其中以洛阳市栾川县钼矿资源最为丰富，被誉为“中国钼都”，其已探明的钼储量达206万t，矿石的日开采量达1.3万t，是亚洲最大的钼矿开采基地［25］。但是，钼矿开采也导致了严重的环境问题［26-30］，余葱葱等［26］在河南洛阳钼矿区的研究发现，受钼矿开采的影响，当地陆浑水库饮用水的钼含量达到严重污染的水平，钼含量超过了标准限值的2.44倍。Yin等［29］研究发现，钼是洛阳钼矿区土壤重金属污染的首要污染物，不同区域钼的污染贡献率均超过了90%。研究进一步证明，土壤中钼含量过高，也会对植物产生毒害作用，造成褪绿和黄化现象，从而影响植物的正常生长［31］，而丛枝菌根作为植物与微生物的共生体，其形成和功能也有可能受到钼污染的影响。但目前对钼矿区丛枝菌根真菌与植物的共生关系及其繁殖和分泌球囊霉素能力的研究还较少。因此，本文采用单因子指数法对土壤受钼污染程度进行分级，对不同钼污染级别下土壤丛枝菌根真菌与植物的共生关系、丛枝菌根真菌的产孢量及其分泌球囊霉素的能力进行分析，以期探明钼污染对丛枝菌根及其重要的分泌物——球囊霉素的影响，为摸清矿区污染土壤中丛枝菌根真菌的特性提供数据支持，以便为今后钼矿区耐重金属的丛枝菌根真菌资源开发及利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与样品的采集和处理

本研究选择河南省洛阳市典型钼矿区为研究区域。研究区域内共设置15个采样点，每个采样点内设置5个20 m×20 m的样方，对各样方内优势植物的植物种进行记录（表1），同时采集每个样方内同种优势植物及其根系周围0～20 cm土壤3～5份，并混合成1份植物和土壤样品。将采集的植物土壤样品带回实验室，风干处理，采用王水消解［32］，用ICP-MS测定土壤钼含量。

根据钼含量的测定值，采用国内外较为普遍的用于某一污染物对土壤污染程度的评价方法——单因子指数法［33-34］。由于中国尚无土壤中钼的环境质量标准，参考对钼污染土壤评价的前人研究［27，35-36］，本文选择法国土壤钼的限定值100 mg·kg-1作为评价标准，计算钼的单项污染指数( Pi，公式为Pi=土壤钼含量/评价标准值)，并参考前人的单项土壤钼污染程度分级标准[27]，将洛阳钼矿区土壤受钼污染程度（Pi）分为4个级别，同时将每个级别下土壤平均钼含量列于表2。

表2 土壤单项污染程度分级标准

1.2 丛枝菌根真菌侵染率和孢子密度的测定

将根系用自来水冲洗干净，剪成约1 cm长根段，采用醋酸-墨水染色法对根系进行染色处理后，在显微镜下观察根系的侵染状况，据Trouvelot等［37］的方法，采用MYCOCALC计算菌根侵染频度（F）、侵染率（M）和丛枝丰度（A）。其中侵染频度反映了所有含有真菌结构的根系占整个根系的比例，而侵染率是在整个根系中真菌侵染出现的频度和侵染强度的综合反映。丛枝丰度表示的是真菌侵染的根段中丛枝结构出现的频度和侵染强度的综合反映。称取10 g风干土样，采用湿筛倾析法［38］对孢子进行分离，在体视镜下对分离出的孢子进行计数，以每克风干土中的孢子数记为孢子密度（Spores density，SD）。

1.3 球囊霉素的测定

球囊霉素，包括总提取球囊霉素（Total GRSP，TG）和易提取球囊霉素（Easily extractable GRSP，EEG），根据Wright等［11］和David等［39］的方法进行测定。

1.4 数据处理

使用SPSS 21.0分别对不同钼污染级别下植物及不同钼污染级别下草本和木本植物的侵染率、孢子密度、球囊霉素含量进行单因素方差分析，对钼矿区所有样品的钼含量、侵染率、孢子密度、球囊霉素间的关系进行Spearman相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同钼污染程度对植物丛枝菌根共生关系的影响

通过对4个钼污染级别土壤中丛枝菌根真菌的侵染指标测定发现，丛枝菌根真菌的菌根侵染频度、侵染率及丛枝丰度在4个钼污染级别间均没有显著差异（P＜0.05）。4个钼污染级别下丛枝菌根真菌的平均菌根侵染频度、侵染率、丛枝丰度分别为50.64%、12.84%、3.92%（图1a）。进一步比较4个钼污染级别的草本植物和木本植物根际的丛枝菌根真菌侵染状况也得到相似的结果（P＜0.05），其中4个钼污染级别下草本植物的平均菌根侵染频度达到55.81%，而木本植物则为44.42%（图1b，图1c）。

图1 不同钼污染级别下AM真菌的侵染状况

2.2 不同钼污染程度对丛枝菌根繁殖能力的影响

通过比较不同级别钼污染土壤样品中的孢子密度发现，丛枝菌根真菌的孢子密度随钼污染程度的加深呈下降趋势，但不同钼污染级别间没有显著差异（P＞0.05），其孢子密度处于14.93～23.83个·g-1风干土范围内（图2a）。通过对相同生活型植物根际的孢子密度在不同钼污染程度下的测定发现，虽然中度钼污染程度下草本植物根际的孢子密度（11.96个·g-1风干土）显著低于无钼污染程度下草本植物根际的孢子密度（27.11个·g-1风干土），但草本植物和木本植物根际的孢子密度在4个钼污染程度间均没有显著差异，草本植物根际的孢子密度变化范围为11.96～27.11个·g-1风干土，木本植物根际的孢子密度变化范围则为17.96～24.88个·g-1风干土（图2b）。

图2 不同钼污染级别下植物根际的孢子密度

2.3 不同钼污染程度对植物根际球囊霉素含量的影响

总体来看，洛阳钼矿区土壤的总提取球囊霉素含量变化范围为1.53～2.85 mg·kg-1，其中重度钼污染条件下的总提取球囊霉素的含量显著低于其他3个级别下的含量。易提取球囊霉素含量的变化范围为0.72～1.47 mg·kg-1，其中无钼污染土壤中的易提取球囊霉素含量显著高于重度钼污染程度下的含量（图3a）。进一步比较4个钼污染级别下草本或木本植物根际土壤的总提取球囊霉素含量发现，在无钼污染和轻度钼污染条件下，草本植物根际的总球囊霉素含量高于重度钼污染条件下的含量（P＜0.05），分别是重度钼污染土壤中总球囊霉素含量的1.77和1.74倍（图3b）。而轻度钼污染和中度钼污染程度下木本植物根际的总球囊霉素含量则显著高于重度钼污染程度下的含量（P＜0.05），分别是重度钼污染土壤中总球囊霉素含量的1.97和1.77倍（图3c）。同时，无论是草本还是木本植物根际的易提取球囊霉素在4个钼污染级别下均没有显著差异。

图3 不同钼污染级别下球囊霉素的含量

2.4 钼含量与丛枝菌根真菌侵染指标、孢子密度及球囊霉素的相关性分析

对钼矿区土壤钼含量与丛枝菌根真菌侵染指标、孢子密度及球囊霉素进行相关性分析，结果（表3）表明，钼矿区土壤的钼含量与丛枝菌根的菌根侵染频度、侵染率、丛枝丰度没有明显的相关关系，而钼矿区土壤的钼含量与孢子密度呈显著负相关（P＜0.05），与总球囊霉素、易提取球囊霉素呈极显著负相关（P＜0.01）。

表3 钼含量与丛枝菌根侵染率、孢子密度、球囊霉素的相关系数

2.5 不同钼污染程度下丛枝菌根真菌的菌根侵染频度、孢子密度和球囊霉素间的关系

对不同钼污染程度下丛枝菌根真菌的菌根侵染频度、孢子密度和球囊霉素进行相关性分析，三者之间的相关分析结果（表4）表明，在4个钼污染级别下，菌根侵染频度与孢子密度间均没有相关性。菌根侵染频度与总提取球囊霉素仅在无钼污染级别下呈负相关关系。中度钼污染条件下，孢子密度与总提取球囊霉素间呈正相关关系。此外还发现，总提取球囊霉素和易提取球囊霉素在4个钼污染级别下均表现出极显著的正相关关系。

表4 不同钼污染程度下菌根侵染率、孢子密度、球囊霉素三者的相关关系

3 讨论

丛枝菌根真菌广泛分布于陆地生态系统，能与大部分陆地植物形成良好的共生关系［1-3］。Shi等［40］通过对不同钼含量梯度下丛枝菌根真菌侵染玉米根系的研究发现，丛枝菌根真菌对钼表现出较强的耐性，且植物的菌根侵染率在钼含量为0～4000 mg·kg-1时没有显著差异，这一结果在本研究中也得到证实。无论是从全部植物的丛枝菌根真菌侵染参数（F、M、A）来看，还是从草本植物或是木本植物的丛枝菌根真菌侵染参数来看，在不同钼污染级别下菌根侵染率均没有显著差异。相关分析结果表明土壤钼含量与丛枝菌根真菌侵染参数之间不存在相关性，说明钼污染不影响丛枝菌根真菌与植物共生关系的形成。在本研究中，洛阳钼矿区植物的菌根侵染频度为49.04%～51.62%，平均达到50.64%。与其他区域相比较高，如凤县铅锌矿区丛枝菌根真菌的菌根侵染频度为28.50%～56.97%，平均值为44.64%［41］；南非西北省某金矿丛枝菌根真菌的菌根侵染频度为9.2%～58.8%，平均值为29.3%［42］；安徽某铜矿丛枝菌根真菌的菌根侵染频度最高值为27.5%［43］，洛阳钼矿区丛枝菌根真菌的菌根侵染频度较高，也说明洛阳钼矿区植物与丛枝菌根真菌能形成良好的共生关系。此前研究发现，土壤中重金属含量高时，丛枝菌根真菌的侵染率和丛枝丰度均较低。如Zarei等［44］在锌含量高达2359.1 mg·kg-1的矿区土壤中发现，丛枝菌根真菌的侵染率和丛枝丰度分别只有9.4%和3.8%；Baba等［45］在锌、镉、铅复合污染的土壤中发现，丛枝菌根真菌的侵染率和丛枝丰度均低于3%。在本研究中，尽管钼矿区植物的菌根侵染频度较高，但轻度钼污染到重度钼污染级别下丛枝菌根真菌的平均侵染率仅达到11.06%，平均丛枝丰度只有3.01%，这一结果与之前的研究结果相一致［44-45］。丛枝是植物与菌根真菌之间进行物质和能量交换的主要场所［46］，洛阳钼矿区较低的丛枝丰度还说明，钼污染虽然不影响植物与丛枝菌根真菌共生关系的形成，但很可能通过抑制丛枝等结构的形成来影响丛枝菌根真菌在菌根共生体中功能的正常发挥。

孢子是菌根真菌储存营养的重要器官和繁殖体［47］。已有研究表明，土壤中重金属的含量对丛枝菌根真菌的产孢能力有一定的影响［21］。Wu等［15］研究发现，丛枝菌根真菌的孢子密度随土壤重金属（铅、锌、铜、镉等）含量的增加而显著降低。孔凡美等［21］研究发现，孢子密度在轻、中度复合污染土壤中较高，随重金属污染程度的增加而锐减。通过对钼矿区土壤的孢子密度测定发现，尽管不同钼污染级别下丛枝菌根真菌的孢子密度间没有显著差异，但丛枝菌根真菌的孢子密度随钼污染程度加深表现出下降趋势（图2a、图2b）。同时，相关性分析结果表明钼含量与孢子密度存在显著的负相关，说明钼含量的提高对丛枝菌根真菌的产孢能力具有明显的抑制作用。此外，洛阳钼矿区土壤的平均孢子密度为19.20个·g-1风干土，其中草本植物和木本植物根际土壤的平均孢子密度分别为18.2和20.3个·g-1风干土。与其他区域，如铅硐山铅锌矿区的孢子密度（平均孢子密度为1.5个·g-1风干土）［16］、曲江砷矿区的孢子密度（平均孢子密度为9.5个·g-1风干土）［15］、郴州铅矿区的孢子密度（平均孢子密度为8.6个·g-1风干土）［15］相比，洛阳钼矿区具有较高的孢子密度，表明该区域中的丛枝菌根真菌对钼污染土壤具有较好的适应能力。

球囊霉素是由丛枝菌根真菌分泌的一种含金属离子的糖蛋白物质，对稳定土壤碳库和固存土壤重金属起着至关重要的作用［12，48-50］。目前，关于球囊霉素与土壤重金属含量之间的关系已有大量研究，但研究结果并不一致。Comejo等［50］发现铜污染区土壤中球囊霉素的含量与重金属铜、锌含量之间存在正相关性。Vodnik等［51］发现铅污染土壤中球囊霉素含量与土壤铅含量之间呈显著正相关关系。而Leal等［17］研究则发现在锌污染区土壤中球囊霉素含量与重金属锌、铜、铅、镉存在负相关性。李华健等［52］也发现土壤总球囊霉素含量与土壤镉含量呈负相关关系。本研究通过对钼矿区土壤中总提取和易提取球囊霉素含量的测定发现，土壤中总提取和易提取球囊霉素含量随钼污染程度的加深表现出下降的趋势，其中重度钼污染土壤中总提取和易提取球囊霉素含量显著低于无钼污染土壤中总提取和易提取球囊霉素的含量。同时相关性分析结果表明，土壤钼含量与总提取和易提取球囊霉素含量呈极显著负相关关系，以上结果说明钼污染程度的加深对丛枝菌根真菌分泌球囊霉素的能力具有明显的抑制作用，这与前人的研究结果相类似。

目前，国内外学者对侵染率和孢子密度之间的关系已开展大量研究，如有结果表明，当丛枝菌根真菌的侵染率高时，丛枝菌根真菌的产孢能力也较高［2，53］，也有一些研究表明二者之间没有明显的相关性［16，54］。本研究通过对洛阳钼矿区丛枝菌根真菌的菌根侵染率和孢子密度间的关系调查发现，不同钼污染程度下，菌根侵染率与孢子密度均没有明显的相关关系，这一结果与班宜辉等［16］和杨梅等［54］的研究结果相一致。同时还发现，总提取和易提取球囊霉素含量与菌根侵染率在无钼污染、中度钼污染及重度钼污染条件下均没有相关关系，上述结果说明丛枝菌根真菌的繁殖能力和分泌球囊霉素的能力受丛枝菌根真菌侵染能力的影响较小，可能与其他土壤理化性质如土壤钼含量的关系更为密切。

4 结论

钼含量与丛枝菌根真菌侵染指标没有相关关系，同时在4个钼污染级别的土壤中，各寄主植物的菌根侵染频度、侵染率及丛枝丰度差异不显著，可见，钼含量不影响丛枝菌根真菌与植物共生关系的形成。

重度钼污染程度下总提取和易提取球囊霉素的含量显著低于无钼污染程度下总提取和易提取球囊霉素的含量，同时钼含量与孢子密度和球囊霉素的相关分析结果表明，钼含量与孢子密度及球囊霉素呈显著负相关，可见，钼含量影响丛枝菌根真菌的产孢能力及其分泌球囊霉素的能力，钼含量的提高对两者有明显的抑制作用。

与之前一些研究结果相一致的是，洛阳钼矿区植物根际土壤的菌根侵染率与孢子密度和球囊霉素间没有显著相关性，可见，丛枝菌根真菌的产孢和分泌球囊霉素的能力受丛枝菌根真菌侵染能力的影响较小。通过对钼矿区丛枝菌根真菌侵染状况、产孢能力及其分泌球囊霉素的调查与研究，为摸清矿区污染土壤中丛枝菌根真菌的特性提供数据支持，以便为今后钼矿区耐重金属的丛枝菌根真菌资源开发及利用提供依据。