尖孢镰孢菌与番茄互作早期milRNA调控功能研究

畅引东，贾仡伟，何瑞，张萌，2，孟广军，李新凤，张作刚*，王建明*

（1.山西农业大学 植物保护学院 农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西 太原 030031；2.山西省植物保护植物检疫中心，山西 太原 030001）

MicroRNA（miRNA）是广泛存在于真核生物细胞中的一类重要内源性非编码小分子，大约由19~30个核苷酸组成。它通常靶向一个或多个mRNAs，通过抑制翻译或者降解靶标mRNAs来调节基因表达［1-2］。真菌中miRNA相关研究起步较晚。温剑等基于成熟miRNA序列在不同物种内具有保守性及其前体结构具有发夹二级结构的特性［3-5］，运用RNA组学方法、生物信息学技术和荧光定量PCR方法率先在真菌酿酒酵母基因组中鉴 定 出32个microRNA-like RNAs（milRNAs）［6］。此后，研究人员基于高通量测序结果运用生物信息学技术参考miRNA数据库（miRBase）中其它物种miRNA数据，对一些真菌菌种进行milRNA的预测，并进一步采用半定量反转录PCR、实时荧光定量PCR、Northern杂交等方法对预测的milR⁃NAs进行验证和功能研究［7］。Fulci等［8］发现Neu⁃rospora crassa中siRNA和milRNA在基因表达调控方面都具有重要作用。Zhou Jiahong等［9］首次报道在植物病原真菌中核盘菌的milRNA与核盘菌的菌核形成和致病过程相关。Zhou Quan等［10］研究发现绿僵菌中milRNA参与调控菌丝生长和产孢的过程。Guo Maowei等［11］研究发现禾谷镰孢菌中Fgmil-2通过反向调控其靶基因FgbioH1调控生物素的合成，从而影响病原菌营养生长、致病性及毒素生成等。冯浩等［7］研究发现苹果黑腐皮壳菌中Vm-milR37通过调控谷胱甘肽过氧化物酶基因VmGP从而增强苹果树腐烂病菌的致病力。植物miRNA不仅在植物细胞中起重要作用，在遭受病原菌侵染时还会被转运进入真菌细胞介导跨界抗病性［12］。植物miRNA跨界出击抗病，病原菌miRNA也会跨界反击植物的免疫响应。冯浩团队发现苹果黑腐皮壳菌Vm-milR1可通过抑制寄主免疫相关受体蛋白激酶基因表达，进而抑制寄主免疫反应促进病菌侵染［13］。这一系列研究成果证实了真菌milRNA不仅对其自身靶标基因的调控机制，有些还可跨界发挥调控功能。真菌milRNA研究将会为阐明真菌生物学过程的分子机理提供新的方向。

尖孢镰孢菌是一种重要的植物病原真菌，具有丰富的遗传多样性和复杂的致病性差异［14-16］。近年来有关该菌种的milRNA研究也逐步展开，但迄今为止，milRNA在镰孢菌与寄主互作中的功能和调控机制报道较少。Chen Rui等［17］对尖孢镰孢菌番茄专化型菌株milRNAs和靶标基因进行了预测，但未对其调控功能进行研究。Jiang Xuefei等［18］通过比较尖孢镰孢菌西瓜专化型菌丝和小分生孢子的深度测序sRNA文库筛选出差异表达milRNAs，发现有2个milRNAs精确调控毒素基因表达。Ji Huimin等［19］发现尖孢镰孢菌番茄专化型菌株在侵染寄主番茄过程中Fol-milR1跨界进入寄主细胞干扰番茄免疫防御体系，从而利于顺利侵入寄主。Li Minhui等［20］首次在尖孢镰孢菌古巴专化型菌株中发现1个包括FoQDE2、milRNA-87及其靶基因FOIG_15013的关键致病轴心，施用外源siRNA可抑制milRNA表达，从而减轻病害症状。上述研究表明尖孢镰孢菌中存在丰富的mil⁃RNA值得进一步研究。

随着基因组学和蛋白组学研究的发展，现已建成庞大的基因和蛋白数据库，通过生物信息学分析可以进一步揭示基因间调控关系［21-22］。借助于STRING蛋白互作网络分析工具［23］、DAVID在线分析工具［24-25］和Cytoscape软件［26］等生物信息学工具可以对蛋白互作信息、基因功能、基因参与的代谢路径等多方面的信息进行预测分析，还可以结合多种属性的互作信息构建出复杂的蛋白调控网络，再结合目标基因的表达水平分析结果，将会更进一步的阐释miRNA和靶基因间的调控机制［27-28］。

本研究拟结合前人的研究结果，采用实时荧光定量PCR技术和STRING蛋白互作网络分析、DAVID在线分析等生物信息学手段对尖孢镰孢菌番茄专化型菌株milRNAs及其靶基因在侵染寄主条件下的基因表达情况和蛋白互作关系进行研究，以揭示milRNAs对靶基因的调控机制，进一步明确尖孢镰孢菌侵染寄主分子机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：尖孢镰孢菌番茄专化型致病菌株

供试植株：番茄品种中蔬四号幼苗

1.2 试验方法

1.2.1 pri⁃milRNA和milRNA靶基因引物设计与筛选

引物设计：参照Chen Rui等［17］预测的尖孢镰孢菌番茄专化型菌株milRNAs信息，使用NCBI基因组数据库网页工具在尖孢镰孢菌番茄专化型全基因组数据中确定primary-milRNAs（pri-milR⁃NAs）的位置。依据pri-milRNA的序列特征，找出pri-milRNA的序列范围。随后选取pri-milRNA序列和milRNA靶基因序列依据实时荧光定量PCR引物设计原则进行引物设计，引物由上海生工生物有限公司合成。随后将引物分别以尖孢镰孢菌番茄专化型菌株和番茄幼苗的RNA反转录后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，通过4%琼脂糖凝胶电泳和观察熔解曲线对引物进行特异性检测。

1.2.2 pri⁃milRNAs及milRNAs靶基因的基因表达分析

参照杜宾等［29］所描述的方法，将供试菌株接种于番茄幼苗；分别对接种后0.5、6、12、48 h的番茄植株根部进行取样。依照RNasio Plus（9108，Takara）的步骤提取总RNA并用qRT-PCR试剂SYBR® Premix Ex Taq II kit（RR470， Takara）反转录合成单链cDNA。以合成单链cDNA为模板，以尖孢镰孢菌tef基因作为内参，选用SYBR Pre⁃mix Ex Taq II试剂盒（RR820，Takara）分别对供试的pri-milRNAs和milRNAs靶基因进行实时荧光定量PCR，测定病原与寄主互作条件下目的基因的表达情况。PCR反应采用两步法，其条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，62 ℃退火15 s，运行40个循环，每次循环的62 ℃退火延伸时收集荧光；在循环结束时从65 ℃开始绘制溶解曲线直到95 ℃，每次增加0.5 ℃，保持5 s，同时收集荧光。每个反应体系设置3个重复，共设2次生物学重复。基因表达数据分析根据目的基因和各个内参基因的阈值循环（Ct），用2-ΔΔCT计算相对表达量，利用Excel 2010和SPSS11.0软件进行处理及单因素方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

1.2.3 milRNAs与其靶基因的蛋白互作网络分析基于Chen Rui等［17］预测的milRNAs靶基因信息，在STRING蛋白互作网络分析网站对靶基因的互作信息进行挖掘，获得一定范围内靶基因的蛋白互作信息和相关的基因信息。将获取的蛋白互作信息导入Cytoscape软件构建蛋白互作网络，并结合milRNAs及其靶基因的调控关系，构建milRNAs与靶基因的蛋白互作网络，再利用Cyto⁃scape软件中的分子复合物检测算法（MCODE）进行互作基因的功能模块分析［30］。通过DAVID在线分析软件对蛋白互作网络中的基因信息进行功能富集分析［24-25］，结合上述研究进一步分析菌株milRNA及其靶基因所涉及的生物学过程及基因功能。

2 结果与分析

2.1 pri⁃milRNA和milRNA靶基因引物设计与筛选

pri-milRNAs的位置及设计的引物信息如表1所示。

表1 pri⁃milRNA位置和引物Table 1 pri⁃milRNA position and its primers

11个milRNA靶基因信息和设计的milRNA靶基因引物信息见表2。

表2 milRNA靶基因引物Table 2 Primers of milRNA target gene

供试引物经实时荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和引物的熔解曲线结果详见图1和图2，在番茄幼苗cDNA模板中因无扩增产物生成未列出。从图1的电泳结果中可以看出，fox_milR⁃NA_1a，e，g的pri-milRNA引物M1、M2和M3的扩增结果有杂带，fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9没有扩增产物；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的扩增结果有杂带，靶基因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引 物T6、T10和T11没有扩增产物；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的扩增条带与目的条带大小一致。

图1 pri-milRNAs和靶基因引物扩增结果Fig.1 Amplified results of primers for pri-miRNAs and their target genes

从图2中可看出，fox_milRNA_1a，e，g的primilRNA引物M1、M2和M3的熔解曲线杂乱，特异性不好；fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9没有熔解曲线，表明无扩增产物生成；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的熔解未形成单峰，特异性不 好；靶 基 因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引物T6、T10和T11没有熔解曲线，表明无扩增产物生成；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的熔解曲线明显为单峰，特异性较好。

图2 pri-milRNA和靶基因引物的熔解曲线Fig.2 Melting curves of primers for pri-miRNAs and their target genes

综上所述，部分milRNAs的pri-milRNAs的基因序列相似性极高（fox_milRNA_1a，e，g），所设计的引物特异性较差。还有一些基因，设计的引物未能扩增出目的条带。因此，只选择部分primilRNAs及其靶基因引物M4、M5、M7、M8、M10、T2、T3、T5和T7进行下一步基因表达实验，初步确定milRNAs基因与其靶基因的调控关系。

2.2 pri⁃milRNAs及milRNA靶基因的基因表达分析

采用实时定量PCR检测尖孢镰孢菌番茄专化型菌株侵染寄主早期初级milRNA及其靶基因的表达情况（图3）。

pri-milRNAs与靶基因的相对表达量结果中反映出供试的尖孢镰孢菌番茄专化型菌株milR⁃NAs及其靶基因的调控关系（图3）。在病原菌侵染番茄后，pri-milRNA_2a的相对表达量呈下降趋势；pri-milRNA_2b的相对表达量随着侵染时间而逐渐上升，在12 hpi时达到高峰，随后显著下降；milRNA_2a和milRNA_2b靶基因FOXG_03470的相对表达量随着侵染时间推移而逐渐下降，在48 hpi时其表达量上升。pri-milRNA_3b在病原寄主互作后的相对表达量呈上升状态，而milRNA_3b靶基因FOXG_04910的相对表达量呈下降趋势。pri-milRNA_4在病原菌与寄主互作6 hpi的相对表达量逐渐上升，在12 hpi相对表达量达到最高，milRNA_4靶基因FOXG_08812在病原和寄主互作后基本未表达。pri-milRNA_6在病原菌与寄主互作6 hpi时相对表达量最高，随后显著下降，而milRNA_6靶基因FOXG_00067的相对表达量值在12 hpi时最高。由此可推断，试验选取的milR⁃NAs与靶基因间基本呈负调控关系。

图3 尖孢镰孢菌番茄专化型菌株侵染番茄时相关基因的定量表达Fig.3 The quantitative expression of related genes of FOL during infection

2.3 milRNA与其靶基因的生物信息学分析

选取的milRNA靶基因经STRING蛋白互作网络同源比对分析，获得靶基因及其蛋白互作相关基因蛋白注释信息和蛋白互作信息（表3）。

由表3中可知，已有的11个靶基因中包括1个奎尼酸透性酶编码基因FOXG_09739、1个甘氨酸脱羧酶复合体H蛋白编码基因FOXG_03470，其余为2个预测蛋白和7个为保守假定蛋白编码基因。其中，这些蛋白中仅有甘氨酸脱羧酶复合体H蛋白（FOXG_03470）和3个保守假定蛋白（FOXG_04240、FOXG_15485、FOXG_15486）能够同其它类型蛋白紧密地参与到蛋白互作网络。

将预测的蛋白互作信息导入Cytoscape软件构建蛋白互作网络，再利用MCODE算法对构建的蛋白互作网络进行功能模块分析，结果如图4所示。从图4中可以看出milRNA_1、milRNA_2、milRNA_3和milRNA_8的靶基因之间的互作联系较为紧密。其中，milRNA_1的靶基因FOXG_04240和milRNA_2的靶基因FOXG_03470能够与诸多的基因进行互作，可假定为该蛋白互作网络中的枢纽基因。该预测的蛋白互作网络中共有3个核心模块，其中模块1包含31个基因，涉及325个互作关系（MCODE score 21.67），模块2包含10个基因，涉及25个互作关系（MCODE score 5.78），模块3包含4个基因，涉及6个互作关系（MCODE score 4）（表3）。模块1与模块3间的互作较为紧密。milRNA_4、milRNA_6和milRNA_7与其它的milRNAs及其靶基因间的互作联系并不紧密，其靶基因为保守假定蛋白和预测的蛋白。

图4 milRNA与靶基因间的蛋白互作网络Fig.4 Protein interaction network of milRNA and its target genes

表3 milRNA靶基因及互作相关联基因信息Table 3 Informations of milRNA target genes and interacted genes

将蛋白互作网络中涉及的基因数据输入DA⁃VID在线分析软件进行基因功能分析，可知该网络主要涉及的分子功能为氧化还原酶活性和GTP结合；生物学过程为小GTP酶介导的信号转导。模块1主要涉及的分子功能为氧化还原酶活性。模块3主要涉及的分子功能为氨甲基转移酶活性、氨基转移酶活性和谷氨酰胺连接酶活性。

续表

3 讨论

miRNA的生物合成最初是由依赖DNA的RNA聚合酶II（Pol II）从基因组DNA中转录出初级miRNA转录本（primary miRNA transcript，primiRNA）［19，31］。随 后，pri-miRNA经 包 含 有Dro⁃sha、RNA聚 合 酶III、DICER-LIKE1和RNAbinding partner DGCR8等多个分子物质的微处理复合体加工为miRNA［31-32］。研究发现miRNAs和其pri-miRNAs在不同处理条件下的表达水平呈现相同的趋势［33-34］，这表明通过研究pri-miRNA和miRNA靶基因的表达水平是初步验证预测miR⁃NA功能的一个很好尝试。本研究通过对尖孢镰孢菌番茄专化型菌株侵染番茄前后pri-milRNAs及相关靶基因的基因表达水平进行分析，以初步明确milRNAs与靶基因间的调控关系，并对靶基因的功能进行分析。综合来看，所涉及的milR⁃NAs与其靶基因之间在一定程度上均呈负调控关系，进一步验证了Chen Rui等［17］的靶基因预测结果。病原菌fox_milRNA_2a和fox_milRNA_2b可能通过调控靶基因FOXG_03470的不同位点来调控该基因。该基因编码甘氨酸裂解酶系H蛋白（表3），通过该甘氨酸裂解酶复合物进行甘氨酸脱羧，将甘氨酸裂解为二氧化碳、氨和亚甲基（GO：0019464）。该基因在侵入寄主初期可能是分别受到fox-milRNA_2a和fox_milRNA_2b的调控微量表达，随后呈逐渐上升趋势，表明该基因菌株的初侵染过程中起到重要的作用。fox_milRNA_3b的靶基因FOXG_04910编码保守的假定蛋白（表3），其参与的生物学过程为调节Rho蛋白信号转导的频率、速率和程度（GO：0035023），而Rho类基因在菌株生长中起重要作用［35］。该基因可能受fox_milRNA_3b调控，在病原菌寄主互作0.5 h时FOXG_04910基因大量表达，随着fox_milRNA_3b相对表达量增长，FOXG_04910基因表达量下将，由此推断该基因可能与病原菌侵染寄主时信号识别有关。fox_milRNA_4、fox_milRNA_6的靶基因FOXG_00812、FOXG_00067分别为预测蛋白和保守假定蛋白（表3），FOXG_00812在菌株与寄主互作早期的表达量较低，而FOXG_00067的基因表达量随着侵染时间延长而逐渐上升，说明其可能与菌株的生长相关。目前，这2个基因的生物学功能尚未公布，基因的具体功能有待于进一步的研究。

病原菌与寄主的互作是一个复杂的生物学过程，需要众多基因来共同协作完成。因此，基于STRING蛋白互作网络平台可通过病原菌已知蛋白间的相互作用探寻目标蛋白互作信息是可行的［36］。诸多的研究结果表明，STRING蛋白互作网络所预测的相关基因功能在基因功能应用中具有较高的可信性［37-38］。本研究中，部分milRNAs及其靶基因因引物设计问题，未能通过基因表达验证两者的靶标关系。但在基于Chen Rui等预测的milRNAs靶基因信息所建立的蛋白互作网络中，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因间的互作较为紧密（图3）；该蛋白互作网络由3个核心模块组成，模块1中基因主要涉及的分子功能为氧化还原酶活性，模块3中基因涉及的分子功能为氨甲基转移酶活性动、氨基转移酶活性和谷氨酰胺连接酶活性。该蛋白互作网络主要涉及的生物学过程为小GTP酶介导的信号转导。其中fox_milRNA_1、fox_mil⁃RNA_2的靶基因FOXG_04240和FOXG_03470能够与多个基因进行互作，可假定为该蛋白互作网络中的枢纽基因，两者与病原菌侵染早期的信号识别密相关。因此，未来进一步对尖孢镰孢菌番茄专化型菌株中其它milRNAs及其靶基因的调控关系作进一步的研究的同时，明确milRNAs与靶基因间的调控关系将会为未来尖孢镰孢菌致病机理研究指明新的方向。

4 结论

综上所述，本研究通过分子试验和生物信息学预测发现尖孢镰孢菌侵染番茄时存在milRNAs及其下游靶基因的调控网络，其中基因相对表达分析证明fox_milRNA_2、fox_milRNA_3、fox_mil⁃RNA_4和fox_milRNA_6与其靶基因可能存在靶标关系；蛋白互作网络结果表明，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因间的互作较为紧密，其中靶基因FOXG_03470在菌株初侵染过程中起到重要的作用，FOXG_04910可通过调节Rho基因影响菌株的生长，推断其可能跟菌株与寄主的信号识别和菌株在寄主中定植有关，为进一步深入探索尖孢镰孢菌milRNA相关功能提供一个新思路。