鬼针草提取物对食道癌细胞的抑制作用及其机理研究

王洁如，劳雅诗，曾鑫海，梁惠芬，刘亚群，杨东娟，郑玉忠，张振霞

（韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041）

食道癌又称食管癌，是常见的消化道肿瘤之一，其发病率及死亡率均较高［1］.它的出现与生活环境、饮食习惯、遗传等因素息息相关；近些年，食道癌患病率呈现逐年上升的趋势，多发于40岁以上男性［2］.食管癌的典型症状表现为进行性咽下困难，逐渐从硬到软甚至到唾液也难以下咽，食道癌的发生会对患者的正常进食及生活质量产生严重影响［2-4］.食道癌中晚期患者难以根治，因此，早期诊断和早期有效治疗对于提升患者治愈率至关重要.对于中晚期患者，即使结合手术和放化疗等方法，也会给患者带来很大的副作用，研究显示食道癌术后不良症状发生率很高［5］，但其病发机制仍不清楚［4, 6］.

鬼针草（Bidens PilosaL.）作为一年生或多年生草本植物，茎直立，在我国各省均有分布，种类较多，为荒地杂草之一［7］.作为中国民间常用草药，鬼针草最早记载于《本草拾遗》，性温，味苦，无毒，全草均可入药，有多种生物活性成分和广泛的药理作用［8-12］；药效化学发现鬼针草含有大量黄酮类［11］、酚酸类等成分，具有清热、解毒、散瘀、消肿等功效.现代研究认为，鬼针草具有抑菌抗炎、抗干眼、抗衰老、抗病毒等作用；在降低患者血压、减轻靶器官的损害方面具有重要作用［13］；能够抑制肿瘤细胞增殖，对白细胞增殖具有体外抑制作用［14］；对急性黄疸型肝炎［15］等有一定的治疗作用.

本研究以食道癌细胞（KYSE150）为研究对象，研究鬼针草提取物对食道癌增殖、黏附、凋亡的影响，同时在分子层面上探讨鬼针草提取物对食道癌的药理机制.有效推动中药鬼针草在预防和治疗食道癌中的运用，降低食道癌的发病率.

1 材料

试剂：芦丁（纯度≧98%）、金丝桃苷（纯度≧98%）、色谱级乙腈、色谱级甲醇、磷酸（AR）；DMEM 培养基、全组分牛血清白蛋白、胰蛋白酶粉；TRNzol Universal Reagent、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、无酶无菌水；反转录试剂盒、PowerUpTM SYBRTM Green、噻唑兰（MTT）、纤连蛋白（FN）、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸钠、硝酸纤维素膜（NC 膜）、ECL 化学发光试剂（enhanced chemiluminescence）；引物（生工生物工程股份有限公司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、一抗（β-actin Mouse）、一抗（Bax Antibody）、二抗（Goat anti-Mouse IgG）、二抗（Goat anti-Rabbit IgG）.

仪器：高效液相色谱仪、Eclipse XDB 色谱柱、电子天平、PH 酸度计、恒温水浴锅、立式压力蒸汽灭菌锅、台式高效冷冻离心机、电热恒温鼓风干燥箱、倒置显微镜、医用超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、超微量核酸蛋白测定紫外可见光光度计、旋涡混合器、二维摇床、酶标仪、LightCycler®96实时荧光定量PCR仪（罗氏）、电转印器、电泳仪、医用低速离心机.

2 方法

2.1 鬼针草提取物的制备

采摘新鲜的鬼针草，置于阳光下晒干.称量100 g 晒干的鬼针草，剪碎置于锅中，加入500 mL水，大火煮沸后中火熬煮2 h，捞出滤渣.滤渣继续加300 mL 水，大火煮沸后中火熬煮1 h，捞出滤渣合并两次滤液，再用过滤装置过滤掉残留的微小滤渣.继续熬煮浓缩至接近稀稠状，量取滤液总量，计算得出鬼针草提取物的浓度.

2.2 鬼针草提取物的分析

将标准品用甲醇溶解并稀释至合适浓度，设置高效液相色谱仪相关参数，色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（Analytical 5 μm 4.6×250 mm）；流动相A：0.1%磷酸水溶液，流动相B：乙腈；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；吸光度：360 nm；柱温：30 ℃.根据表1的高效液相洗脱程序对液相色谱仪进行方法设置，重复实验.通过绘制标准曲线，测定样品中芦丁和金丝桃苷的浓度，计算其在样品中所含含量.

表1 高效液相洗脱程序

2.3 MTT法检测细胞活性

将细胞状态良好的食道癌接种于10 mL 培养皿（含血清和培养基）中，培养48 h，进行细胞传代，调整细胞浓度为1.2×104个/mL.在96 孔板上标记好加药浓度、时间等信息，每孔接种200 μL 细胞液，静置培养24 h.计算及预混含有不同浓度鬼针草提取物（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的新鲜DMEM，培养24 h 后，在避光条件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培养4 h 后，加入150 μL/孔的DMSO.在二维摇床上震荡15 min，用擦镜纸擦拭96孔板底部后，在酶标仪490 nm处检测OD值，利用软件作图得出细胞增殖的趋势.

2.4 黏附性法检测细胞相互作用

取1 mL 的FN 工作液（0.2 mg/mL）用9 mL 的PBS 溶解稀释，加入50 μL/孔稀释后的FN 工作液于96孔培养皿中，用锡纸包裹做避光处理，置于冰箱中4 ℃培养24 h.取1 g的BSA粉末加50 mL的PBS 溶解，调节pH 至7.4 后，用0.22 μm 滤膜过滤除菌，加入100 μL/孔封闭液封闭1 h.每孔加入含有不同浓度鬼针草提取物和DMEM 的混合液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL），培养1.5 h 后，在避光条件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培养4 h后，加入150 μL/孔的DMSO.在二维摇床上震荡15 min， 于酶标仪490 nm 处检测其吸光度，利用软件作图得出细胞的黏附趋势.

2.5 实时荧光定量PCR检测细胞基因表达

将细胞浓度调整为1.8×105个/mL 的细胞液接种于6 孔培养皿中，培养24 h，分别加入含有不同浓度鬼针草提取物（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的DMEM 的混合液，继续培养24 h.用PBS清洗细胞两次后备用.采用TRIzol 法分离和提取总RNA，用赛默科技的反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA.

在NCBI设计引物，得到所需信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成.引物信息如表2 所示，以β-actin为内参，加入正向和反向引物，以及试剂盒中其他反应液，形成PCR反应体系，设置PCR反应程序，进行扩增，得到相关基因的表达量.

表2 引物序列信息

2.6 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达

将细胞接种于10 mL 培养皿中，细胞生长覆盖率为70%时，用PBS 清洗细胞后，分别加入含有不同浓度鬼针草提取物和DMEM 的混合液（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），继续培养24 h，用PBS 清洗细胞两次后备用.使用RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白；采用BCA法定量蛋白，按试剂盒操作，绘制蛋白标准曲线并测定蛋白浓度，确保等量的细胞进行电泳上样.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统分离蛋白样品，浓缩胶80 V 恒压电泳20 min，分离胶120 V恒压电泳110 min，然后电转至NC膜.脱脂奶粉封闭60 min，4 ℃孵育一抗16 h以上.一抗浓度分别为Bax（1：2 500）、β-actin（1：5 000）.洗膜后加入二抗（1：10 000），4 ℃孵育2 h，ECL化学发光显影.进行FCQ拍摄，测定条带灰度值并计算蛋白相对表达量.

2.7 数据分析

该研究所得数据采用平均值±标准差表示，运用Origin 软件进行单因素方差统计学分析.各组间数据比较分析采用Tukey检验.*表示P＜0.05，为差异有统计学意义.**表示P＜0.01，为差异有显著统计学意义.

3 结果

3.1 鬼针草提取物的浓度测定

100 g 晒干的鬼针草，加水熬煮，重复两次，合并滤液继续浓缩至稀稠状，量取滤液，计算得到鬼针草提取物物质含量为145.625 mg/mL.

3.2 鬼针草提取物含量分析

根据HPLC 检测结果，制得芦丁和金丝桃苷标准曲线，芦丁Y=15033X+43.683（R2=0.999 9）、金丝桃苷Y=205 66X+37.807（R2=0.999 5）.利用标准曲线计算，可知在鬼针草提取物中，芦丁含量为0.996 mg/g、金丝桃苷含量为1.390 mg/g.

3.3 鬼针草提取物对食道癌细胞增殖的影响

如图1（抑制增殖*P＜0.05，**P＜0.01）可知鬼针草提取物对食道癌细胞的抑制作用整体上呈抑制作用加强的趋势.药物浓度大于1 mg/mL时抑制作用明显，且其抑制效果具有显著的量效关系.初步说明鬼针草提取物能抑制食道癌细胞的增殖活动.

图1 鬼针草提取物对食道癌细胞增殖的抑制作用

3.4 鬼针草提取物对食道癌细胞黏附的影响

细胞黏附分子使细胞-基质-细胞间发生黏附，以受体-配体结合的形式发挥作用，参与细胞的增殖与分化，是检验肿瘤转、移免疫应答等的必要手段.如图2（抑制黏附*P＜0.05）所示，在药物浓度为1.4 mg/mL 时，鬼针草提取物对食道癌细胞参与黏附的活动起显著的抑制作用，进一步表明鬼针草能抑制食道癌细胞间的信息交流与迁移.

图2 鬼针草提取物对食道癌细胞黏附特性的抑制作用

3.5 鬼针草提取物对相关基因表达的影响

鬼针草提取物对食道癌增殖具有抑制作用，可能与凋亡基因表达有关联.结果如图3（促进基因表达*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）所示，鬼针草提取物能刺激细胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表达量呈剂量依赖的上升趋势，其中对Bak和Bax的影响比后两者更加显著，说明鬼针草对细胞促凋亡基因的影响有差异，可能是由于不同凋亡基因的作用机制不同.

图3 鬼针草提取物对基因表达的影响

3.6 鬼针草提取物对BAX蛋白表达的影响

以β-Actin 为内参，研究鬼针草提取物对BAX 蛋白表达量的影响，如图4 和图5（促进蛋白表达*P＜0.05）所示，鬼针草提取物能诱导BAX 蛋白表达水平呈上升趋势，且浓度越高，上调越明显.与Bax基因的mRNA表达量趋势相似，从蛋白水平上验证了鬼针草对食道癌细胞凋亡的诱导效应.

图4 鬼针草提取物对BAX蛋白表达的影响

图5 鬼针草提取物对BAX蛋白表达量的影响

4 结论与讨论

鬼针草为中国民间常用草药，主治多种炎症，具有清热解毒、散瘀活血的功效［7］.近年研究发现，鬼针草提取物具有抗肿瘤作用［16］，但其作用机制尚不清楚.鬼针草主要成分是黄酮类化合物，在降低血压、调节血脂、抗肿瘤以及抗炎等方面具有显著的药理作用［17］.鬼针草黄酮类物质中，主要有槲皮素、芦丁［18］、金丝桃苷、木犀草素等，其中芦丁和金丝桃苷具有一定的抑癌作用［19-21］，因此鬼针草在抗癌研究上具有良好的前景.

为此，本文研究了鬼针草对食道癌的抑制作用及机制.结果显示，高浓度的鬼针草提取物能抑制食道癌的细胞增殖，对食道癌细胞黏附活动起到一定抑制作用，破坏了食道癌细胞间的信息交流与转移，从而导致细胞凋亡.说明鬼针草作为民间常用草药在预防以及治疗癌症中具有抑制癌细胞增殖扩散、诱导细胞凋亡的作用，从而发挥其药性.

我国是世界上食管癌高发地区之一，且只能早发现早治疗，其治愈率也不高.对此，本文进一步研究鬼针草对不同的细胞凋亡基因的调节作用.结果显示，鬼针草提取物能诱导细胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表达量呈上升趋势，其中对前两者的影响比后两者的更显著，说明鬼针草对细胞凋亡基因的影响有差异.本文还研究了鬼针草提取物对BAX 蛋白表达量的影响，结果表明BAX蛋白表达量呈上调趋势，说明鬼针草可以通过调控BAX 蛋白表达诱导细胞凋亡.通过查阅大量文献，Bax促凋亡基因不是单独起作用，而是与P53、Bcl-2等基因通过不同比例而共同诱导细胞凋亡［22］；对于正常细胞来说，通过下调Bax/Bcl-2 的比例抑制正常细胞的凋亡［23］；对于癌细胞来说，可以通过Akt/Bcl-2/Bax信号通路诱导癌细胞凋亡，抑制增殖，进而发挥抗肿瘤的作用［24］.从总体而言，鬼针草可能主要是通过增加Bax的mRNA 量，导致其蛋白表达量的增加，从而诱导细胞发生凋亡.因为，食道癌细胞周期调节的关键蛋白Cyclin D1 与Cyclin E 的表达下调，将食道癌阻滞于G0/G1期，其机制可能系BAX 蛋白上调所介导的［25］.流式细胞术检测试验表明，凋亡蛋白BAX 蛋白的上调激活了线粒体通路，破坏线粒体膜电位，导致了凋亡的发生［26］.

综上所述，鬼针草提取物对食道癌的增殖、转移、扩散具有一定的抑制作用；对细胞促凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表达量呈上升趋势；进一步上调BAX 蛋白表达量，诱导细胞凋亡.目前，国内在鬼针草的作用机制这方面的研究较少，如细胞膜、靶细胞、BMP、Wnt等信号通路，有待进一步深入探究分析，后续研究可以主要集中在鬼针草对食道癌产生抑制机制的信号通路，或以小鼠模型加以验证，进一步完善鬼针草的作用机制，为后续治疗食道癌提供一定实验依据.