兰花病毒检测与脱毒技术研究进展

黎文敏 薛铭 谢利 郭和蓉 张志胜 曾瑞珍

摘要 兰花病毒病是制约兰花产业发展的重要因素，其中由建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（odontolossum ring spot virus，ORSV）引起的病毒病在全球范围内影响广泛且危害严重。目前兰花病毒病尚无特效药可以防治，加强检疫、及时销毁染病植株以及采用无病毒种苗是病毒病防治的有效措施。因此，对引起兰花病毒病的主要病毒、病毒检测方法和脱毒技术研究进展进行综述，以期为兰花脱毒技术的深入研究和脱毒苗工厂化生产提供参考。

关键词 兰花;CymMV;ORSV;检测方法;脱毒技术

中图分类号 S 436.8  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）03-0008-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.002

Research Progress on Technology of Virus Detection and Virus-removing in Orchids

LI Wen-min， XUE Min， XIE Li et al

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract Orchid virus disease is an important factor restricting the development of orchid industry， among which causing by Cymbidium mosaic virus （CymMV） and Odontoglossum ring spot virus （ORSV） are widespread and harmful orchid virus diseases in the world. At present， there are no chemical pesticides for effective prevention and control of the diseases， therefore， strengthening quarantine of the viruses， destroying infected plants in time and adopting virus-free seedlings for cultivation are effective prevention and control measures in production. Therefore， focuses on advancements on the kinds of orchid viruses identified， the technologies of detection and virus-removing of the main virus in orchid， in order to provide reference for further studying on virus-removing techniques and production of virus-free seedling in orchid.

Key words Orchid;CymMV;ORSV;Detection method;Virus-removing technology

基金项目 广州市农业农村局项目（19100210，20101396 ）; 广东省现代农业产业技术体系花卉创新团队项目 （2021KJ121 ）;清远市科技计划项目（2021DZX021）;英德市科技计划项目（英科字〔2021〕19号-10）。

作者简介 黎文敏（1997—），女，广西梧州人，硕士研究生，研究方向：花卉遗传育种。通信作者，副研究员，硕士，从事花卉遗传育种研究。

收稿日期 2021-09-28

兰花是兰科植物（Orchidaceae）的总称，约有763个属，28 000种[1]。兰花株型优美、花型独特、花期多样，深受各国人民喜爱，市场前景广阔。近年来，随着国内外贸易和种质资源交换的增加以及兰花种植规模的扩大，兰花病毒病危害日趋严重，对兰花产业发展构成了严重威胁[2]。目前，国内外尚无特效药防治兰花病毒病，加强检疫、及时销毁染病植株和采用无病毒种苗生产是减少病毒病发生和危害的有效措施[3-4]。该研究综述侵染兰花的主要病毒、病毒检测方法和脱毒苗生产技术，对未来脫毒技术的研究和应用进行了讨论，以期为更好开展兰花脱毒苗生产，促进兰花产业发展提供参考。

1 侵染兰花的主要病毒

1943年，澳大利亚Magee首次报道了建兰上的一种“黑病”，后被证实为建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）引起的病毒病[5-6]。此后，国内外关于引起兰花病毒病的病毒种类报道逐渐增多。据Lee等[7]统计，全球范围内能侵染兰花的病毒有57种，主要包括齿兰环斑病毒（ORSV）、建兰花叶病毒（CymMV）、辣椒褪绿病毒（capsicum chlorosis virus，CaCV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、凤仙花坏死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）、兰花斑点病毒（orchid fleck virus，OFV）、落葵皱纹花叶病毒（basella rugose mosaic virus，BaRMV）、菜豆黄花叶病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）等。

建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）是世界范围内对兰花影响广泛、造成经济损失严重的2种兰花病毒[1，8]。建兰花叶病毒（CymMV）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒颗粒呈线状，能使建兰叶子表面产生褪绿色斑点和局部坏死斑、树兰（Epidendrum）产生花叶症，卡特兰（Cattleya）产生局部坏死等[9]。齿兰环斑病毒（ORSV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），病毒颗粒呈直杆状，侵染兰花后的主要症状表现为叶子表面出现黄化条纹或不规则褪绿斑块、坏死斑、黑斑等，黄化部位有时出现凹陷，有些花朵上产生褪色斑、花朵畸形等[10]。肖火根等[11]在感病的墨兰（Cymbidium sinense）、文心兰（Oncidium）、大花蕙兰（Cymbidium hybridum）等兰花样品中检出CymMV与ORSV。丁元明等[12]从云南省兰花基地可疑感病兰株中检测出CymMV和INSV复合感染。Sudha 等[13]在万代兰（Vanda）中检测出CymMV、ORSV、番茄斑点枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）和Poty virus复合感染。说明多种病毒可以同时侵染兰花，这种复合感染比单一病毒感染危害更严重，可导致叶片坏死或产生坏死斑，花朵畸形或花瓣碎色，植株矮小、黄化或萎蔫等。

2 兰花病毒检测技术研究进展

病毒检测是兰花脱毒苗生产和病毒病防控的关键环节之一[14]。早期病毒病诊断采用症状观察法[15]，目前在兰花生产依然采用该方法初步判别兰花是否感染病毒，但由于兰花品种多，症状表现影响因素多，有时存在隐症及多重感染等现象，因此该方法较难对侵染病毒进行精确鉴定。为了更快、更准确、更简便地对兰花病毒进行鉴定，研究者开发出多种病毒检测方法（表1），主要包括指示植物法[16]、电镜观察法[17]、血清学检测法[18-20]、分子生物学检测法[21-23]等。采用这些方法可以对CymMV、ORSV、CMV、TMV、BYMV、CaCV、OFV、BaRMV等病毒进行准确检测[16-23]。

指示植物法是将携带有病毒的兰花汁液通过摩擦接种至特定的指示植物上，通过观察寄主植物的病症表现来诊断侵染兰株病毒种类的方法[16]。指示植物检测方法是国内外早期检测兰花病毒的传统方法之一，具有操作简单、成本低的优点，但其对操作环境条件要求严格，检测速度慢，显症时间长，常与其他检测方法配合使用[30]。

电镜检测法通过观察植物病毒颗粒大小、形状、内含体组成和染色组织超微结构等方面的特征来鉴定病毒种类的方法[17]。该方法检测速度较快，准确性比指示植物法高，但由于该方法制片过程复杂，仪器设备和人员技术要求高，不适用于大批量检测[17]。近几年，国内在生产中较少使用该方法，国外常与其他检测方法配合使用进行少量样本检测[31-32]。

血清学检测法是利用病毒蛋白与特异性抗体相结合的原理对病毒进行检测的方法[18-20]，主要包括酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[33]、快速免疫滤纸测定法（rapid immunofilter paper assay，RIPA）[34]、免疫毛细区带电泳法（immuno-capillary zone electrophoresis，I-CZE）[35]和免疫胶体金技术[36-37]。其中酶联免疫吸附检测法（ELISA）是血清学中应用最广泛的检测方法，为了缩短检测时间、提高检测的准确性和灵敏度，研究者以ELISA为基础开发出了双抗体夹心酶联免疫（DAS-ELISA）[36，38]、斑点酶联免疫（Dot-ELISA）[39]和三抗体夹心酶联免疫（TAS-ELISA）等技术[40]。

分子生物学方法是通过检测病毒核酸来鉴别病毒种类的方法[21-23]，主要包括核酸杂交技术（nucleic acid hybridization）[41]、分子信标技术（molecular beacons）[42]、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）[43]、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[44-45]和微阵列芯片检测技术[46-47]等。其中RT-PCR操作简便、检测快速，是分子生物学中应用最广泛的病毒检测方法[48]。

为建立更快速、更简便、特异性和灵敏度更高的兰花病毒检测方法，有研究者分别在电镜技术、血清学和分子生物学等已有的检测方法基础上进行创新，建立了液相色谱/质谱联用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）和激光解吸-离子化质谱分析法（matrix-assisted laser desorption-ionization，MALDI）[24]、石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）免疫傳感器[25]、磁还原测定法（magnetoreduction assays，MRA）[26]、光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）[27]、光纤粒子等离子体共振（fiber optic particle plasmon resonance，FOPPR）免疫传感器[28]、微/纳米混合结构免疫-电化学生物传感器（micro/nano hybrid-structured immuno-electrochemical biosensor）[29]等检测新技术，由于这些技术对仪器设备要求高、专业技术性强、迄今并未大量应用于生产实际。

3 兰花脱毒技术研究进展

自Morel[49]于1960年采用茎尖培养进行兰花脱毒苗生产以来，兰花脱毒技术研究取得了明显进展。迄今为止，已开发出茎尖培养脱毒[49-60]、化学处理脱毒[54-55，61-65]、热处理脱毒[54-55，66]、病毒A处理结合花梗组织培养脱毒[67]和超低温处理脱毒[68-70]等技术，建立了卡特兰、文心兰、大花蕙兰、石斛兰、蝴蝶兰、杂交兰、虎雪兰等兰花脱毒苗生产技术体系（表2）。

茎尖培养脱毒是根据植物顶端分生组织缺少成熟的维管束与其他部分相连接，从而减缓病毒向顶端移动，导致该部位较少含有或不含病毒，因此通过茎尖培养生产脱毒苗的方法[49-60]。茎尖培养脱毒是兰花脱毒苗生产中常用的技术，其脱毒效果与兰花种类、茎尖大小等关系密切。朱根发等[51-52]采用茎尖培养成功生产出文心兰和大花蕙兰的无病毒种苗。丁兰等[56]切取大小为0.40～0.80 mm的蝴蝶兰茎尖进行培养，其成活率达到67.37%，但没有培养出完全脱除CymMV和ORSV的脱毒苗。景维杰等[57]研究发现，采用带1个叶原基，大小为0.20～0.40 mm的蝴蝶兰茎尖进行培养，能生产出完全脱除CymMV和ORSV的脱毒苗。

化学处理脱毒是将甲基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、叠氮胸苷、三氮唑核苷、DHT和病毒唑等化学物质加入培养基中或直接处理培养材料，杀死病毒或抑制培养材料内病毒的复制，从而达到脱毒目的的方法[54-55，61-65]。化学处理结合茎尖培养能提高兰花脱毒率，比单独使用茎尖培养脱毒效果好，也有研究者同时采用化学处理和热处理结合茎尖培养进行兰花病毒的脱除，脱毒率高达100.00%[55]。

热处理脱毒是应用最早的植物脱毒方法之一，它是利用病毒不耐高温的特点，通过热处理使病毒钝化，从而实现去除植物体内病毒的方法[54-55，66]。Stone[66]研究表明，单一热处理对脱去兰花CymMV和ORSV效果不明显。贺嘉[54]采用38/32 ℃变温热处理蝴蝶兰试管苗35 d，结合2.00 mm茎尖培养进行脱毒，CymMV脱毒率为46.67%。靖晶[55]对蝴蝶兰试管苗进行 36 ℃ 热处理15 d后，结合3.00 mm茎尖培养进行脱毒，结果显示 CymMV与ORSV 的脱毒率均为71.40%。目前对外植体材料进行热处理后结合茎尖培养已成为兰花脱毒苗生产的有效方法。

超低温处理脱毒是近几年来发展的兰花脱毒新技术，原理是利用超低温（-196 ℃）选择性将病毒杀死，从而脱去植物中的病毒[68-70]。李涵等[68]以携带CymMV与ORSV的杂交兰根状茎为材料，经过低温炼苗21 d后，采用包埋玻璃化超低温保存法结合茎尖培养，成功脱除病毒，脱毒率为100.00%。王玉英等[69]、王仁睿等[70]等应用玻璃化超低温法对虎雪兰、蝴蝶兰进行脱毒培养，成功脱除CymMV与ORSV和CymMV。由于超低温处理脱毒法对温度控制要求苛刻，操作繁杂，使用不当容易致死植物，目前尚未在脱毒苗生产中广泛采用。

4 结语

病毒病是兰花的“癌症”，显著影响兰花产量和质量，是制约兰花產业可持续发展的重要因素。兰花病毒病防控可以采用培育抗病毒品种[1，71]、建立有效防控技术、采用脱毒苗等手段进行。由于病毒变异速度快，而抗病毒品种选育需要时间长，因此目前采用选育抗病品种的方法防控兰花病毒病在生产实际中应用较少，在没有有效防治病毒病技术的情况下，采用脱毒苗就成为减少病毒病危害的重要手段。

自20世纪60年代建立兰花茎端分生组织培养脱毒技术以来，兰花脱毒技术和病毒检测方法取得了一定进展，但脱毒苗在兰花生产上应用并不广泛，主要原因是脱毒技术难度大，脱毒苗在生产应用中因二次感染导致实际效果不明显等。因此要推动脱毒苗在生产上的广泛应用，今后应加强以下几个方面的研究工作：①进一步加强脱毒技术研究，建立简便稳定高效的脱毒技术体系，这是生产上利用脱毒苗减少病毒病造成损失的关键;②深入研究单一病毒和多种病毒对兰花的危害，为制定有效脱毒方案提供指导;③建立更多兰花病毒的检测和脱毒技术体系，为脱毒苗生产提供技术支撑;④加强防止脱毒苗二次感染技术研究，确保脱毒苗应用的效果。

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