外泌体在骨肉瘤中的研究进展

李增佑，舒雄，刘辉琦，刘永年

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肉瘤[1]，患者年龄呈双峰分布，其中儿童和青少年（中位年龄为 18 岁）的发病率最高，是儿童癌症相关死亡的首要疾病，60 岁以上老年人的发病率位居第二，峰高较低[2]。在世界范围内，骨肉瘤的年发病率为每百万人 1～3 例[3]。骨肉瘤起源于间充质来源的原始转化细胞，具有恶性程度高、易复发、易转移、预后差等特点，大约 20% 的骨肉瘤在诊断时已扩散到肺、脑或其他器官[4]。目前通过新辅助化疗等模式对治疗有良好反应的患者的 5 年生存率可以达到 60%，但对化疗反应差和（或）诊断时发现有肺转移患者的 5 年生存率只有 27%，而在过去 40 年中这一点并未得到显著改善[5-7]，因此需要积极探索新的治疗方向。

外泌体是细胞在生理或病理条件下分泌的直径 30～150 nm，具有脂质双分子膜结构的囊泡[8]。1983 年，Johnstone 等[9]首次在羊成熟网织红细胞体外培养中发现直径大约 50 nm 的活性囊泡并将其称为外泌体。电镜下外泌体呈双凹圆盘状或杯口状，表面有特异性的分子标志物，如CD63、CD81、CD9、TSG101 等[10-11]。研究发现外泌体能在大多数血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液、精液等生理液体中存在并参与了体内多种生理活动[12-14]。外泌体起源于细胞内吞活动，其形成首先是由质膜向内出芽后产生早期核内体，之后由核内体转化为多囊泡体，多囊泡体最终在溶酶体进行降解或与细胞膜融合后以外泌体的形式释放到细胞外环境[15-16]。几乎所有外泌体都含有核酸、蛋白质、脂质和代谢物等在内的多种生物活性分子[17-18]，这些物质以外泌体为载体运输至相邻或更远的受体细胞，从而影响不同的信号级联反应。

新近研究发现，骨髓间充质干细胞来源的外泌体与阿霉素结合可抑制骨肉瘤的发展[19]。Kucharzewska 等[20]发现缺氧的多形性成胶质细胞分泌的外泌体可以通过激活血管内皮细胞因子进而促进血管生成，源自人类乳腺癌细胞的外泌体含有 UCH-L1 和 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），能够通过上调 P-gp 的表达来诱导阿霉素耐药性[21]，同时外泌体在肺癌细胞和微环境之间传递间充质相关信息，参与上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）过程[22]。这些研究表明外泌体与恶性肿瘤的发生、迁移、耐药及血管生成等密切相关，同时外泌体可用于新的肿瘤治疗方法以及临床诊断（标志物和液体活检试验），并且也可用于药物载体、疾病靶点和预后监测[23-25]。

Garimella 等[26]在生物荧光骨肉瘤原位移植小鼠模型中通过透射电子显微镜检测到外泌体的存在，并发现外泌体通过破坏骨肉瘤骨微环境中的骨重塑稳态来驱动破骨细胞骨吸收，同时外泌体膜表面特征性分子还可以作为骨肉瘤早期诊断及判断预后的重要指标。外泌体作为一种新型的载体或细胞间通讯工具，通过携带的不同物质发挥着不同的生物学效应，影响着肿瘤的发生发展。骨肉瘤外泌体中包含多种细胞信息传递物质，通过这些物质，外泌体能将肿瘤细胞中肿瘤相关蛋白、RNAs 等物质转移到其他非肿瘤细胞中影响其他细胞表型，从而增强肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力。

1 外泌体在骨肉瘤微环境中的作用

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是一个复杂的生态系统，与肿瘤发生和发展的各个阶段密切相关，肿瘤增殖、免疫逃逸、迁移和侵袭、血管生成等基本特征也受到肿瘤微环境的影响[27]。TME 中几乎所有细胞都分泌外泌体[28]，而外泌体基于其含量及膜结构的特异性，能携带多种生物活性物质从细胞膜释放入微环境中，在骨肉瘤细胞间物质交换和信息交换中起着重要的作用。Vallabhaneni等[29]证明，应激间充质干细胞的外泌体通过细胞间通讯可以影响骨肉瘤细胞的转移潜能。

2 外泌体在骨肉瘤血管生成中的作用

血管生成是肿瘤细胞的基本特征，骨肉瘤更是恶性间叶组织肿瘤，血道转移是其主要转移方式，因此骨肉瘤中血管生成是其发生发展的关键因素[30]。研究发现外泌体可以作为肿瘤中促血管生成介质的有效载体从而刺激血管生成[31]。Perut 等[32]发现骨肉瘤来源的外泌体中含有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、内皮抑制素、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）和 CD105 等一系列血管生成相关蛋白，这些蛋白都不同程度参与了病理性血管的生成，为肿瘤生长提供了便利的条件，促进了肿瘤的生长。骨肉瘤来源外泌体还可通过刺激血管内皮细胞从而促进血管生成。Tao 等[33]研究发现骨肉瘤外泌体将尤文氏肉瘤相关转录因子 1（Ewing sarcoma associated transcript 1，EWSAT1）从肿瘤细胞运输至血管内皮细胞，通过“双重堆积效应”诱导肿瘤的血管生成。而且骨肉瘤细胞来源外泌体血小板源性生长因子 BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）可以直接被人脐静脉内皮细胞摄取，诱导肿瘤血管生成，从而促进骨肉瘤生长[34]。研究证实外泌体介导的 miRNA 从肿瘤细胞转移到血管内皮细胞会破坏内皮细胞屏障，促使肿瘤细胞释放到血液中进行扩散和转移[35]。以上研究表明骨肉瘤来源的外泌体在骨肉瘤细胞与内皮细胞间运输血管生成相关蛋白，从而调控肿瘤微环境中的血管重构，促进骨肉瘤微环境血管生成并进而促进了肿瘤的生长。

3 外泌体在骨肉瘤上皮-间质转化中的作用

EMT 是上皮细胞丧失细胞极性、获得侵袭性并获得间充质表型的生物学过程[36]。EMT 是一个可逆的过程，肿瘤细胞如果经历间质到上皮细胞的转变（间质-上皮转化，mesenchymal-epithelial transition，MET）可以重新获得上皮细胞表型，因此 MET 被定义为间充质细胞向上皮细胞的完全重编程，可以在正常发育和肿瘤转化过程中的不同发育阶段生成上皮细胞[37]。骨肉瘤是一种间充质细胞来源的骨癌，其间充质来源的肉瘤细胞已经具备上皮细胞 EMT 诱导的典型表型特征，无需经过 EMT 获得。这就引出了一个问题：间质来源的骨肉瘤细胞是否会进行 EMT[38]？研究发现大多数骨肉瘤细胞表现出上皮或间充质和上皮的混合表型[39]，因此 EMT 和 MET 都可以发生在骨肉瘤细胞中。骨肉瘤细胞在早期转移阶段会进行 EMT，从而脱离其初始位置，并使细胞获得侵袭性和迁移性[40]。当骨肉瘤细胞转移至肺部等区域后，通过 MET 过程，适应新环境并生长[39]。

骨肉瘤细胞可以通过 Wnt/β-catenin 信号通路发生EMT 及侵袭[41]。该信号通路同时激活 Snail、Slug 和 Twist等多个 EMT 相关的转录因子，这些转录因子的上调会增加波形蛋白和纤维连接蛋白等间质标志物的表达[42-43]。Okamura 等[44]发现骨肉瘤中 EMT 转录因子 Twist1 通过调节基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）天然抑制剂 TIMP1 的表达参与肿瘤侵袭，而且 Zeb 蛋白可以通过下调 E-cadherin 诱导 EMT，导致细胞极性丧失、基底膜结构改变和重塑，增加肿瘤细胞迁移和侵袭能力。骨肉瘤来源的外泌体还可以携带多种蛋白及核酸，不但通过激活Wnt/β-catenin 信号通路诱导肿瘤 EMT 过程，还可以通过调控外泌体携带 EMT 转录因子相关生物活性物质，达到直接或间接控制癌细胞 EMT 的作用。过表达 miR-143 的外泌体可以直接靶向 MYO6、HMB1、ERK5、Activin A 和LAMP3 mRNA，最终抑制 Twist1、Snail 和 Slug 等转录相关因子[45-46]。

研究发现 Ovo 样锌指蛋白 2（Ovo like zinc finger 2，OVOL2）通过结合 ZEB1 启动子抑制 ZEB1 的表达，在骨肉瘤细胞中过表达 OVOL2 可以促进 MET，从而抑制细胞迁移和侵袭[47]，表明通过调控 EMT 转录因子的转录活性可以实现对骨肉瘤细胞的 MET 状态的调控。此外，miRNAs 可以通过调控 E-cadherin 的表达诱导 MET，如miR-23b、miR-29c、miR-194 和 miR-200 可以下调 Twist1和 ZEB1，导致 E-cadherin 表达上调[39]。因此骨肉瘤来源的外泌体与 EMT 密切相关，通过 EMT-MET 促进骨肉瘤的侵袭与转移。

4 外泌体在骨肉瘤化疗耐药中的作用

多药耐药（multiple drug resistance，MDR）是骨肉瘤患者治疗失败的一个关键性问题[48]。产生耐药改变的肿瘤细胞通过外泌体中耐药相关 miRNA、蛋白等将耐药性传递给药物敏感细胞，导致药物敏感细胞失去对化疗药物的敏感性而引起耐药。研究发现耐药肿瘤细胞可以分泌含有 P-gp 的外泌体，这种外泌体可以使药物敏感的肿瘤细胞出现耐药表型。研究发现在骨肉瘤阿霉素耐药变种 MG-63DXR30 细胞的外泌体中存在 P-gp，通过外泌体将 P-gp 传递到受体细胞，从而将 MDR 表型细胞转移到敏感细胞，使敏感细胞演变为不敏感细胞而形成化疗耐药[49]。同时研究证实骨肉瘤细胞中外泌体 miR-133a 与骨肉瘤的耐药相关[25]。因此，明确骨肉瘤来源外泌体在耐药性传递过程中起到关键作用，可以为耐药骨肉瘤患者治疗提供新的思路。

5 展望

来自骨肉瘤的外泌体可以通过改变肿瘤微环境、肿瘤血管生成、肿瘤EMT/MET 及耐药等多方面促进骨肉瘤的进展。同时由于肿瘤来源外泌体内含物表达异常，并具有反映肿瘤状态的能力，外泌体可以作为骨肉瘤诊断和预后的生物标志物。随着进一步的研究发现，外泌体具有通过特定蛋白质或核酸从而靶向特定细胞和组织的优点。其中骨髓基质细胞来源的外泌体 miR-206 可以转移到骨肉瘤细胞并通过靶向人转化因子 2β（transformer 2β-homolog，TRA2B）从而抑制肿瘤进展[50]，而骨肉瘤细胞外泌体中内源性 miR-25-3p促进毛细血管形成和血管内皮细胞侵袭[51]。多项研究都证明了外泌体在骨肉瘤的发生、发展中发挥着重要作用。相信随着对骨肉瘤来源外泌体研究的不断发展，将会进一步推动对骨肉瘤的研究并为骨肉瘤的诊断与治疗提供新的思路。