嵌合抗原受体T细胞疗法联合免疫调节剂治疗实体瘤研究进展

董佳艺 陈斯泽 邵丽娟 宋明瀚

广东药科大学附属第一医院肿瘤科（广州 510000）

近年来肿瘤免疫细胞治疗无耐药性、毒副作用少、疗效显著。过去十年见证了新型肿瘤免疫精准靶向疗法CAR-T细胞，开创了肿瘤治疗新路径。CAR-T细胞疗法已被批准用于血液肿瘤的治疗，但在实体瘤中的作用仍不尽人意，因此，许多研究通过探索联合治疗来提高实体瘤CAR-T治疗疗效。除放疗、化疗、靶向药物、细胞因子、肿瘤疫苗和溶瘤病毒，近年许多团队不断探索CAR-T细胞新的联合方法，免疫调节剂。临床前及临床研究表明，合理的肿瘤免疫联合治疗，可诱导更多免疫细胞到肿瘤微环境，并持续活化，产生持续抗肿瘤反应；CAR-T细胞接受长期抗原刺激会出现耗竭现象，这一现象在实体肿瘤模型中表现更显著，免疫调节剂可减少T细胞耗竭，从而增强疗效。

本文将首先介绍CAR-T背景，进一步综述目前CAR-T细胞联合免疫调节剂的临床前及临床研究，包括免疫检查点抑制剂、干扰素基因刺激物激动剂、来那度胺，并对其现状、真实特性、机制展开综述，最后讨论其未来前景和挑战。

1 CAR-T细胞疗法

目前CAR-T细胞已经历五代。第一代CAR-T细胞在T细胞基础上嵌入特异性抗原识别的跨膜结构域，因其缺乏共刺激信号，无法完全激活抗肿瘤活性，有持久性欠佳、体内扩增不良缺点。第二代CAR-T细胞引入了共刺激结构域和诱导共刺激因子，克服T细胞持久性低和肿瘤定位差等问题，是当前主流CAR-T细胞，有较多的临床研究数据支持，且稳定性高、制备工艺成熟。第三代CARs在共刺激结构域上加入两种信号序列，但会降低T细胞刺激阈值，细胞因子过量分泌产生毒副反应，不足以提升效果。在第二代的基础上加入诱导释放肝素酶或细胞因子（主要为IL-12），重塑肿瘤免疫微环境，形成了第四代CAR-T，提高治疗效率。第五代CARs的基础也是第二代，添加IL-2受体β片段，防止终末分化，重建免疫系统，但其安全性和有效性有待证实。为了降低肿瘤复发率有研究者设计了CD19/CD20双靶CAR-T细胞［1］，以及实体瘤对双靶CAR-T细胞反应的数学模型，理论证明了肿瘤细胞在免疫抑制的情况下，双靶CAR-T细胞可提高疗效［2］。

2 CAR-T联合免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）通过阻断免疫检查点通路，逆转T细胞的耗竭状态、免疫逃逸现象，增强机体抗肿瘤能力。目前主要免疫检查点包括程序性死亡受体1（programmed cell death receptor1，PD-1）、程序性死亡配体1（programmed cell death-ligand1，PD-L1）和细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein4，CTLA-4）。

2.1 PD-1抑制剂 回输CAR-T细胞并使用PD-1抑制剂，是最早、最广泛的联合方法。早在2013年研究团队［3］已证明PD-1抑制剂联合CAR-T细胞使髓样抑制细胞（MDSC）的百分比降低，增强对同基因小鼠模型乳腺癌细胞的杀伤作用；二者联合使抗HER2阳性乳腺癌细胞的细胞毒性由39.85%升高至49.5%，诱导CAR-T细胞扩增，增加IL-2和IFN-γ分泌［4］；也可克服HER2阳性/PD-L1阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药［5］。胶质母细胞瘤相关研究表明，PD1抑制剂激活靶向抗原后可增加anti-HER2-CAR-T细胞活化，进而增强疗效［6］。在甲状腺癌方面，PD-1抑制剂联合靶向ICAM1的CAR-T细胞可促进PD-L1表达的肿瘤集落快速清除，延长小鼠总生存期（OS）［7］。前列腺癌研究中，PD-1抑制剂对anti-hPSMA-CAR-T细胞杀伤功能有直接影响，使肿瘤内CD3+T细胞密度增加约13倍，提高其活化、增殖和效应功能［8］。在宫颈肿瘤方面，5只小鼠接受GPC1特异性mCAR-T细胞与PD-1抑制剂联合治疗后，其中2只表现为肿瘤完全根除，且无不良反应［9］，该研究使用宫颈鳞状细胞癌为肿瘤模型，未来可以选择其他表达GPC1的肿瘤模型，进一步探索CAR-T联合ICIs的疗效。2021年有团队对恶性胸膜相关肿瘤进行临床研究，在证明PD-1阻断可增强小鼠CAR-T细胞功能后，18例恶性胸膜间皮瘤患者也安全接受了PD-1抑制剂治疗，这些患者OS为23.9个月，8例患者病情稳定（SD）持续6个月以上，2例患者PET-CT显示完全代谢反应，表明胸腔灌注靶向间皮素的CAR-T细胞联合PD-1抑制剂治疗恶性胸膜瘤安全有效［10］，在此临床实验中，另外入组有1例转移性非小细胞肺癌和1例表皮生长因子受体2阴性的乳腺癌患者，这些恶性胸膜疾病患者未使用PD-1抑制剂联合治疗，未来可以探索其他恶性胸膜疾病使用CAR-T细胞联合PD-1抑制剂的安全性及有效性。

“外源性”PD-1抑制剂因导致自身反应性T细胞激活而增加了免疫抑制相关毒性，为克服这一点，研究团队探索“内源性”联合方式，为CAR-T细胞实体肿瘤联合治疗提供了安全、有效的新策略。其一，将编码PD-1抑制剂的序列构建到载体中，得到自身分泌PD-1抗体的CAR-T（CAR.αPD1-T）细胞，并通过异种移植小鼠模型试验证实CAR。αPD1-T细胞在肿瘤、血液和脾脏中高速扩增，延长小鼠OS［11］，在毒性最小的情况下取得了100%ORR和80%CR［12］。其二，CarlJune团队证明CRISPR工程T细胞对肿瘤患者安全有效后，陆续有研究证实，PD-1敲除的EGFRvIII特异性CAR-T细胞［13］、PD-1缺失的CD19特异性CAR-T细胞［14］、PD-1破坏的间皮素特异性CAR-T细胞［15］分别在EGFRvIII阳性胶质母细胞瘤细胞、CD19阳性K562白血病细胞、三阴乳腺癌细胞中增强细胞毒性，使CAR-T细胞PD-1表达减少，并分泌更多细胞因子，避免免疫抑制，提高体内外抗肿瘤活性，降低肿瘤复发率。另外，在T细胞表面过表达截断胞内信号段的PD-1受体或重组PD-1蛋白是免疫疗法组合新类型，这种组合方式需要进一步探索。

本研究小组评估了PD-1基因敲除anti-MUC1-CAR-T细胞治疗晚期非小细胞肺癌的安全性（NCT03525782），这是首次尝试使用PD-1基因敲除技术治疗实体瘤。报告中包括6例患者的数据，CAR-T细胞输注后2周内，所有患者症状明显改善，回输后血清CYFRA21水平下降，回输4周后升高。其中2例患者肺部病灶在治疗后4周内明显缩小（1例从25 mm×19 mm×22 mm减少到14 mm×10 mm×26 mm）。虽然有3例患者细胞因子水平升高，但未观察到细胞因子释放综合征（CRS），数据表明PD-1基因敲除是安全的，且耐受性良好。但联合治疗的疗效具有病例特异性，表现为一些NSCLC患者反应良好，而在其他患者中没有观察到明显的反应［16］。

2.2 PD-L1抑制剂 CAR-T细胞激活会导致肿瘤细胞PD-L1表达增多，从而导致自身功能下降，现已证实，淋巴细胞清除后，CAR-T细胞联合抗PD-L1可改善CAR-T细胞介导的肿瘤免疫反应，增强抗肿瘤作用［17］。2021年有团队将CAR-T细胞和PD-L1抗体修饰的血小板以及包载IL-15的纳米颗粒同时装载进一个生物相容性较好的可植入水凝胶中，CAR-T细胞因水凝胶缓释作用得到可控释放，避免了快速释放引起细胞失活，同时可释放IL-15维持细胞活性，并在特定条件下触发血小板的激活释放PD-L1抗体阻断PD-L1，增强CAR-T细胞杀伤能力，抑制癌症复发［18］。间充质干细胞（MSCs）递送并产生功能性病毒以感染和裂解肺肿瘤细胞，同时通过释放IL-12和PD-L1抗体增强CAR-T细胞抗肿瘤活性及其细胞因子分泌功能［19］。

2.3 CTLA-4抑制剂 CTLA-4是T细胞表面表达的免疫蛋白，其阻断会引起淋巴细胞增殖，抑制肿瘤生长，提高生存率，为免疫检查点免疫抑制性抗肿瘤治疗提供理论依据。2021年，伊匹木单抗（Ipilimumab）被国家药品监督管理局（NMPA）批准上市，成为我国第一且唯一正式获批的CTLA-4抑制剂。

为改善CAR-T细胞功能，有团队制备了mRNA编码硫酸软骨素蛋白聚糖4（CSPG4）和小干扰RNA（siRNA）的特异性CAR-T细胞，以下调PD-1和CTLA-4，增强了体外CAR-T细胞功能增强，为黑色素瘤免疫治疗提供了新思路［20］。同为ICIs，CTLA-4抑制剂与PD-1抗体解除免疫抑制作用不同，有研究发现Ipilimumab可使T细胞过度活化［21］，抗体诱导CTLA-4溶酶体降解［22］，导致免疫治疗相关不良事件，带来严重副作用。虽然靶向CTLA-4的抗体已广泛应用于多种实体瘤，联合治疗适应证探索数目众多，但目前暂未涉及CTLA-4抑制剂与CAR-T细胞联合治疗研究，其联合治疗毒副反应更是不可忽略，若在抗肿瘤免疫治疗过程中，“保留”免疫检查点CTLA-4而非“阻断”，是否可以不影响治疗效果的情况下减少免疫相关毒副作用值得进一步探索。

2.4 其他 B7-H3是一种Ⅰ型膜蛋白免疫检查点分子，与PD-L1细胞外结构域序列相似，其异常高表达与肿瘤发生发展、免疫逃逸、不良预后有关。

B7-H3在非小细胞肺癌中过表达，B7-H3特异性CAR-T细胞有效控制NSCLC生长，其与CCL2趋化因子/CCR2趋化因子受体轴相结合，增强抗肿瘤活性［23］。B7-H3是CAR-T细胞治疗脊索瘤的潜在靶点，B7-H3-CART细胞识别脊索瘤细胞后可抑制肿瘤形成，增强CAR-T细胞活化和细胞因子分泌［24］。另外研究表明泛组蛋白去乙酰化酶抑制剂［25］、分次辐照（FIR）［26］可增强B7-H3-CART细胞的抗肿瘤活性。目前有B7-H3-CART治疗恶性皮肤肿瘤单臂临床研究正在招募中，但暂无B7-H3抑制剂联合CAR-T细胞的临床研究。

3 CAR-T联合干扰素基因刺激物激动剂

干扰素基因刺激物（stimulator of interferon gene，STING）是一种免疫调节因子，通常处于自我抑制状态，受到配体刺激引起构象变化而激活，介导干扰素调节转录因子IRF3磷酸化，诱导产生Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子，使肿瘤免疫细胞活化，有研究［27］表明STING激动剂可促进黑色素瘤微环境中的血管正常化和三级淋巴结构形成，STING激动剂还可增强肿瘤特异性CD8+T细胞的运输和激活以有效抑制胰腺癌进展［28］，2022年1月，新型小分子STING激动剂已获批静脉输注给药治疗晚期实体瘤并开展临床研究，为肿瘤免疫治疗带来新的希望。

STING激动剂联合Th/Tc17-CAR-T细胞通过介导免疫刺激和抑制之间的平衡，增强CAR-T细胞持久性，促进其转运，STING通路在ICIs的作用下，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤［29］，在使用STING激动剂的Th/Tc17-CAR-T细胞中添加PD-1抑制剂和GR-1抑制剂才能实现持续的肿瘤消退，加入PD-1抑制剂克服耗竭（内部修饰），使用GR-1抑制剂消除抑制骨髓细胞（外部修饰）导致肿瘤持续缓解，与未接受抗GR-1治疗对照组相比，接受抗GR-1 mAb的小鼠CCL2、G-CSF和IL-6显着增加［30］。该研究为CAR-T细胞联合GR-1抑制剂等其他药物提供了新的思路，同时在未来研究中须谨慎其联合所带来的相关毒副作用。

2020年有团队得出结论，Mn2+以cGAS-STING依赖的方式极大地促进树突状细胞和巨噬细胞的成熟、抗原递呈，增强CD8+T细胞分化、NK细胞活化，在接受肿瘤皮下种植后，Mn2+缺乏小鼠的肿瘤发生率增高7倍，且静脉接种会诱导更强的肺转移，Mn2+与免疫检查点抑制协同提高抗肿瘤功效，降低小鼠所需的PD-1抗体剂量，并且文章提到在一项晚期转移性实体瘤Ⅰ期临床试验初步结果表明，Mn2+具有良好的免疫增强作用：20名患者（90.9%）的疾病得到持久控制，其中包括10例患者（45.5%）被评估为PR，其中8例PD-1抗体抵抗的患者有6例实现了部分缓解（PR），2例疾病稳定（SD），同时有6例患者盆腔粘连得到改善，Mn2+可改善免疫原性低（冷肿瘤）或抗PD-1反应低的癌症患者疗效［31］。Mn2+与免疫治疗联合使用值得进一步探索，其与CAR-T疗法联合也将成为可能，但神经毒性不容忽视。

4 CAR-T联合其他免疫调节剂

来那度胺的免疫调节作用包括：通过免疫调控促进T细胞、NK细胞功能、增加NKT细胞数量、增强IFN-γ的分泌、抑制单核细胞促炎细胞因子释放、直接增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用［32］；其次，可激活胞内Notch信号传导、旁分泌IL-2，增强PD-1阻断和肿瘤内CD8+T细胞活化，从而改善肿瘤免疫微环境［33］。

早在2015年，研究［34］表明来那度胺通过增强CAR-T和抗原呈递细胞的免疫突触来提高对神经胶质瘤细胞的杀伤作用。2018年研究［35］发现CS1-CAR-T细胞联合来那度胺，可诱导分泌更多Th1细胞因子，增强CAR-T细胞记忆维持、免疫突触形成和细胞毒性，提高多发性骨髓瘤疗效。目前来那度胺联合CAR-T治疗实体瘤的研究甚少，其联合治疗实体瘤相关机制值得进一步探索，且有望为实体瘤治疗困境提供新的突破。

5 总结与展望

CAR-T细胞治疗面临许多机遇和挑战，CAR结构的不断优化、新靶点的不断探索，CAR-T细胞治疗将得到更广泛的临床应用，为CAR-T联合治疗铺垫良好基础。在CAR-T细胞培养到患者回输前这一时间段，患者可接受局部放疗提高疗效且耐受性良好［36］，这种联合疗法可以预防肿瘤进展，并可能通过放疗异位效应增强CAR-T细胞疗效［37］，但其最佳放疗剂量和放疗与CAR-T细胞的治疗顺序仍待进一步探索。抗代谢类化疗药物可增强CAR-T细胞功能［38］，在CAR-T细胞治疗前的淋巴清除方案中加入铂类化疗药奥沙利铂，可改善肿瘤免疫微环境［39］。靶向药物例如BTK抑制剂在CAR-T联合治疗中研究最为广泛，可改善CAR-T细胞活性，降低严重CRS风险［40］。部分细胞因子和共刺激分子已被证明在调节T细胞的发育和功能方面发挥重要作用，可促进CAR-T细胞扩增，增加记忆表型CAR-T细胞提高持久性［41］。CAR-T细胞联合溶瘤病毒可促进宿主免疫系统对肿瘤相关抗原（TAA）的识别，以基因改造方式增强CAR-T细胞抗肿瘤活性［42］。肿瘤疫苗可使CAR-T细胞快速激活和扩增从而提高疗效［43］。

近年，许多团队不断探索CAR-T细胞新的联合方法以克服实体肿瘤治疗的不利条件，CAR-T联合其他免疫相关治疗越来越受到关注。结合临床前和早期临床观察结果，CAR-T细胞与免疫调节剂联合策略可能为肿瘤治疗提供机会，解决实体肿瘤免疫治疗相关挑战，包括肿瘤免疫抑制环境、肿瘤部位可及性。目前，免疫检查点抑制剂是许多癌症免疫治疗的基础，还有干扰素基因激动剂、来那度胺这些新型免疫调节药物，为CAR-T联合治疗提供了新的思路。

对于“外源性”联合来说，大多数研究中受试者接受CAR-T细胞治疗后再接受免疫调节剂，免疫调节剂的最佳剂量、合理的给药间歇和给药顺序都需要进一步明确，其条件和相应机制也尚不清楚。免疫调节剂不同的给药方式及其对CAR-T细胞的影响和药物联合使用内在机制同样需要我们在未来得出结论。对于“内源性”联合，CAR-T细胞靶点和免疫检查点阻断这种组合相比于“外源性”是否可能更有效地促进抗肿瘤治疗，仍需要进一步探索。对于患者来讲，第一，联合治疗可能增加治疗成本，如何减少成本而达到最优治疗需要在实践中总结经验；第二，联合治疗可能增加药物毒副作用，其毒副反应需要实践记录，有文献表明ICIs相关内分泌反应较为常见［44］，其中包括爆发型的糖尿病症状和严重的糖尿病酮症酸中毒为首发症状的ICIs介导型糖尿病［45］，联合治疗是否会加重其内分泌相关毒副反应需得到足够的临床关注，其潜在机制和治疗措施也需要进一步实践探索；第三，对于新型免疫调节剂的联合使用，其耐药性和长期疗效需要进一步探索。

CAR-T疗法在实体瘤治疗方面得到越来越多的关注，其联合治疗更是在近些年颇受关注。在未来，将会有越来越多基于CAR-T联合治疗的临床试验，将提供丰富的数据，为开发有效的CAR-T联合治疗提供思路。