冰温贮藏对猪肉宰后品质及糖酵解途径相关酶活性的影响

林珩迅，何兴兴*，张成云，关文强*

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

肉类因其富含高价值蛋白质、B族维生素、微量元素和其他生物活性化合物，是补充人体所需营养的优质食物来源[1]，中国作为全世界最大的肉类生产和消费国，肉类年产量占全球总量1/4[2]。鲜肉最常规的贮藏方式是冷藏，既将肉贮藏在0～4 ℃温度下，这对于细胞代谢和微生物生长的抑制作用有限，保质期较短，无法达到长期贮藏的目的[3]。冰温贮藏技术指将食物置于其冰温带（0 ℃与结冰温度之间）进行贮藏，冰温贮藏既避免了冻结破坏食物组织结构，又可以利用较低的温度降低机体生理代谢，抑制微生物生长[4]，进而起到延长食品保质期的作用，现已被广泛的运用于果蔬[5-6]、海产品[7]及肉类[8]保鲜贮藏。许立兴等[9]研究冰温贮藏对鸡肉品质的影响，发现对比4 ℃冷藏，冰温对延缓鸡肉品质劣变效果更显著，可将保质期延长13 d。辜雪冬等[10]发现，冰温条件下牦牛肉的保水性及蛋白质稳定性均优于冷藏。此外，有研究表明低温更有利于维持鲜肉的感官品质及卫生指标[11]。

糖酵解是指葡萄糖在无氧条件下转变为丙酮酸并生成ATP所经历的一系列反应，禽畜宰后肌肉糖酵解及相关代谢途径如图1所示。为了维持代谢平衡，宰后肌肉中的糖原和葡萄糖通过糖酵解途径分解产生丙酮酸。在有氧条件下丙酮酸会继续进行有氧分解，但由于宰后肌肉血液流动和供氧停止，糖酵解过程产生的丙酮酸会在乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的催化下生成糖酵解终产物——乳酸[12]。丙酮酸还原为乳酸的过程又被成为单纯乳酸发酵过程。糖酵解速率直接影响肉宰后品质[13]。因此研究肉贮藏过程糖酵解途径中关键控制酶的活性变化规律，明确贮藏温度对这些关键酶活性的影响，对确保宰后肉品质具有重要意义，同时可为鲜肉贮藏方式的选择提供理论指导。

图1 肌肉宰后糖酵解及相关代谢途径[14]Fig.1 Glycolysis and related metabolic pathways in postmortem muscle[14]

目前，冰温贮藏技术已被应用于各类禽畜肉的宰后保鲜，但是从糖酵解代谢机理角度来探讨冰温条件对鲜肉贮藏过程中品质及糖酵解相关代谢酶活性的变化规律鲜有报道。本研究以猪里脊肉为原料，以（4.0±0.2）℃冷藏作为对照，研究（-1.0±0.2）℃冰温贮藏对猪肉品质及宰后糖酵解途径中相关酶活性的影响，以期为冰温贮藏技术在肉及肉制品加工贮藏产业中的运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪里脊肉（‘大白猪’）购自天津二商迎宾肉类食品有限公司。选择体质量、身体健康状况相近的适龄大白猪，屠宰后立即取8 条脊椎骨内侧小里脊条，放入内置冰块的便携式保温箱运回实验室。

聚乙烯自封袋购自桐城市名生复合包装有限公司。

磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、ADP、1,6-二磷酸果糖、NADH、3-磷酸甘油酸、ALD、GAPDH、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、β-巯基乙醇、LDH、PGK、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 上海源叶生物有限公司；6-磷酸葡萄糖、G6PDH、PK、聚乙烯吡咯烷酮、Tris-HCl、6-磷酸果糖、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、PGK检测试剂盒、G6PDH检测试剂盒、PK检测试剂盒、HK检测试剂盒、GAPDH检测试剂盒、PFK检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；TPI检测试剂盒 上海酶联生物有限公司；HK、3-磷酸甘油醛、TPI、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、PFK、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES）、ALD检测试剂盒、LDH检测试剂盒 美国Sigma公司；KCl、MgSO4、葡萄糖 福晨化学试剂有限公司；甘油 天津大茂化学试剂公司；二硫赤鲜醇上海生化试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Testo 205便携式pH计 德图仪表（深圳）有限公司；ME204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；A41-1012-119R.B（USA-Dbs）色差仪 美国Hunter Lab公司；TG16-WS台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；Spark 10M-酶标仪 帝肯上海贸易有限公司；FA2004A电子天平 上海精天仪器有限公司；GQB-700KB温度梯度箱 天津捷盛东辉保鲜科技有限公司；FLUKO匀浆机FA25 上海鲁硕实业有限公司；IKA T10高速组织匀浆机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

剔除小里脊条表面脂肪、筋膜后分割成48 块大小约为6 cm×4 cm×2 cm、质量为40 g左右长方体小块，采用自封袋包装，分别置于（4.0±0.2）℃和（-1.0±0.2）℃温度梯度箱贮藏，整个过程在1 h内完成。分别于0.5、2、6、12、24、72、120、168 h取样，进行汁液损失率、色泽、pH值测定，然后迅速采用液氮冻结置于-80 ℃冰箱贮藏待后续相关酶活力测定。

1.3.2 汁液损失率测定

参照Honikel[15]的方法，准确称量样品贮藏前质量（m1/g）、贮藏后质量（m2/g），根据下式计算汁液损失率。

1.3.3 色泽测定

使用色差仪对猪里脊肉进行色泽测定，每块样品分别测定3 次，每次取不同的面，记录L*值（亮度）、a*值（红度）和b*值（黄度），结果取平均值。

1.3.4 pH值测定

使用Testo 205便携式pH计测定样品pH值。将探头插入样品几何中心，每次穿刺深度大于2 cm，保证肌肉组织与探头充分接触，待示数稳定后直接读数，每块样品重复3 次，结果取平均值。

1.3.5 酶活力测定

1.3.5.1 粗酶液的制备

参考王芳[16]的方法并稍作修改。称取样品10 g，加30 mL提取液（50 mmol/Lβ-巯基乙醇、体积分数12.5%甘油、8 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris-HCl、0.5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.5）后在液氮条件下研磨，将肌肉组织匀浆后全部装入离心管中，5 095×g、4 ℃下离心10～15 min，收集上清液，在4 ℃低温下保存备用。

1.3.5.2 酶活力的测定

本实验采用酶偶联法测定糖酵解及相关代谢途径中9 种酶的活力[17]。该法利用的原理为NADH和NADPH均在340 nm波长处有光吸收，并且都能产生荧光，其激发波长和发射波长分别为340 nm和460 nm，而NAD+和NADP+则无此特性。向反应体系中加入过量的底物、辅助因子和偶联酶，使底物在待测酶、偶联酶催化下反应，生成或消耗NADH和NADPH。使用酶标仪测定单位时间内340 nm及460 nm波长处吸光度的变化，计算出相应酶的活力。各酶活力测定具体操作和计算公式参照各试剂盒的说明书。

1.4 数据统计分析

实验各项指标至少重复3 次，数据采用Excel 2010和Origin 9.1统计分析软件进行数据整理及作图，用SPSS 26.0软件进行Duncan’s差异显著性分析（P＜0.05表示差异显著）以及Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度对猪肉汁液损失率的影响

猪肉宰后会发生一系列复杂生理生化反应，导致肌肉纤维蛋白的持水性降低，发生不同程度的汁液流失且伴随营养物质损失。猪肉的保水能力是重要的品质参数[18]。由图2可知，随着宰后时间的延长，猪肉的汁液损失率逐渐升高。在168 h时，4 ℃贮藏条件下猪肉的汁液损失率为2.16%，-1 ℃贮藏条件下猪肉的汁液损失率为1.73%，在25 h后，-1 ℃样品汁液损失率均低于4 ℃样品（P＜0.05）。说明冰温贮藏条件有利于降低猪肉宰后汁液损失。You等[19]在过冷贮藏对牛排品质的影响研究中得出相似结论。

图2 不同贮藏温度对汁液损失率的影响Fig.2 Effects of different storage temperatures on drip loss

2.2 不同贮藏温度对猪肉色泽的影响

贮藏期间微生物滋生和自身生理生化反应会导致肉的色泽发生变化。色泽是评价鲜肉品质好坏的重要指标之一，直接影响消费者的购买欲望[20]。由图3A可知，在贮藏期间肉的L*值呈现先增加后减小的趋势，贮藏初期L*值升高是因为汁液渗出引起肉表面折光率变化[21]，随着贮藏时间的延长，肌肉长期暴露在空气中，肌红蛋白被氧化成高铁肌红蛋白，亮度下降[22]。a*值的变化如图3B所示，贮藏期间猪肉的a*值先减小后增大。宰后猪肉中肌红蛋白与空气中的氧气接触迅速转变为鲜红色的氧合肌红蛋白，使得鲜肉a*值初值处于较高水平[23]；但随着氧化的进行，高铁肌红蛋白逐渐取代氧合肌红蛋白，肉的颜色从鲜红色向深褐色转变，a*值下降；而后期a*值再次增大可能是肉中某些乳酸菌及其他微生物的作用，导致高铁肌红蛋白转化为具有红色泽的肌红蛋白衍生物所致[24]。-1 ℃贮藏组a*值则大于4 ℃贮藏组，这与Christensen等[25]的研究结论相同，过高的温度导致可溶性肌红蛋白含量降低，a*值降低。猪肉贮藏过程中b*值变化趋势和L*值变化趋势类似（图3C），b*值的变化可能与猪肉内部一系列化学反应及脂肪氧化有关。整体来看，贮藏期间-1 ℃贮藏条件下的猪肉L*值与b*值均小于4 ℃贮藏组，这是因为4 ℃贮藏组汁液损失更为严重，对肉表面折光率影响更大，导致L*值更高。

图3 不同贮藏温度对色差值的影响Fig.3 Effect of different storage temperatures on color difference

2.3 不同贮藏温度对猪肉pH值的影响

动物肌肉一般呈中性，但宰后由于肌肉进行无氧代谢产生乳酸，pH值降低。当pH值下降至极限值后，随着糖酵解酶失活及蛋白质分解所产生的氨类及胺类等碱性含氮物质，肉的pH值逐渐升高。pH值的下降速率与极限pH值直接影响肉的品质[26]。

如图4所示，在宰后24 h内，-1 ℃和4 ℃贮藏条件下的猪肉pH值均值呈现下降趋势，分别由最初的6.38和6.33分别降至5.56和5.51，之后随着贮藏时间的延长，pH值逐渐升高。与4 ℃贮藏相比，-1 ℃贮藏的猪肉样品pH值下降速率更为缓慢且极限pH值更高。说明冰温可以减小宰后pH值的下降程度，进而延缓猪肉成熟进程。李培迪[27]在冰温贮藏羊肉的研究中得到了相同的结论。

图4 不同贮藏温度对猪肉pH值的影响Fig.4 Effect of different storage temperatures on pH

2.4 不同贮藏温度对糖酵解及相关代谢途径酶活力的影响

糖酵解影响着猪肉宰后的成熟与腐败，糖酵解及相关代谢途径酶活性的变化对肉品质的发展至关重要[28]，不同温度贮藏过程中猪里脊肉糖酵解酶活力变规律化如图5所示。

由图5可知，随着贮藏时间延长，PFK、ALD、GAPDH、PGK、PK、G6PDH活力逐渐降低最后稳定，HK、TPI、LDH活力在贮藏初期急剧升高后逐渐降低，这与郑晓寒[29]的研究结果一致。宰后ATP的快速消耗与磷酸肌酸缓冲体系的消耗会在短期内提高HK、TPI、LDH等酶活力，但随着pH值的不断降低，逐渐偏离酶的最适pH值，且某些代谢产物对酶活性具有抑制作用，因此贮藏中后期这些酶活力不断下降。

猪肉宰后由于血液循环停止，肌肉供氧中断，主要进行糖酵解反应。在糖酵解反应中，HK、PFK催化的反应为不可逆反应，ALD和PFK对糖酵解的调控有着至关重要的作用。在无氧条件下，糖酵解途径产生的丙酮酸经单纯乳酸发酵最终被还原生成乳酸，催化上述反应的酶为LDH，其活力能直接反映猪肉宰后无氧代谢的能力[30]。由图5可知，在0.5～12 h贮藏期间，-1 ℃处理组样品中HK、PFK、LDH活力显著低于4 ℃处理组（P＜0.05），说明冰温可以有效降低糖酵解关键调控酶活力。冰温对于PGK活性也有一定的抑制效果。不同温度处理对ALD、TPI、GAPDH、PK活性影响的效果差异不大。除糖酵解途径外，宰后少部分葡萄糖进入戊糖磷酸途径产生五碳糖、二氧化碳、无机磷酸和NADPH，G6PDH是促使葡萄糖分子的代谢转移至戊糖磷酸途径的关键酶。在宰后2～12 h内，-1 ℃条件下G6PDH活力显著高于4 ℃处理组，说明4 ℃条件下猪肉的分解代谢速率比-1 ℃条件下更快[31]。

图5 不同贮藏温度对糖酵解及相关代谢途径酶活力的影响Fig.5 Effects of different storage temperatures on glycolytic enzyme activities

2.5 糖酵解途径相关酶活力及猪肉品质间的相关性分析

糖酵解速率直接影响肉宰后乳酸堆积，进而改变pH值变化速率及极限pH值，最终造成肉的色泽、持水力等品质差异[32]。本课题前期研究了猪肉宰后乳酸含量的变化[31]，因此将本实验测定的4 ℃与-1 ℃贮藏下猪肉相关指标及乳酸含量进行Perason相关性分析，结果分别见表1、2。

表1 4 ℃贮藏条件下糖酵解及相关途径中酶活力及猪肉品质间的相关性分析Table 1 Correlation analysis between glycolytic enzyme activities and pork quality during storage at 4 ℃

表2 -1 ℃贮藏条件下糖酵解途径中相关酶活力及猪肉品质间的相关性分析Table 2 Correlation analysis between glycolytic enzyme activities and pork quality during storage at -1 ℃

如表1、2所示，在4 ℃和-1 ℃条件下，猪肉的pH值与乳酸含量及LDH活力呈显著或极显著负相关（P＜0.05、P＜0.01），乳酸含量与LDH活力呈极显著正相关（P＜0.01）。此外，4 ℃条件下，乳酸含量与HK、TPI、LDH活力呈显著或极显著正相关（P＜0.05、P＜0.01）。在糖酵解的过程中，肌糖原被分解并经过一系列的反应最终产生乳酸，乳酸含量直接影响肉宰后pH值，随着乳酸含量的增加，pH值不断下降至及极限值；贮藏后期，底物的消耗、糖酵解及相关酶活力逐渐降低及蛋白质变性产生胺及氨类碱性物质，导致pH值逐渐升高最后趋于平缓。说明冰温环境通过抑制贮藏前期HK、PFK、LDH等糖酵解酶及相关代谢关键酶活力，减缓糖酵解反应速率，延缓乳酸积累，从而控制贮藏前期pH值下降速率，延缓猪肉品质劣变。

在4 ℃和-1 ℃条件下，pH值与L*值和b*值呈极显著负相关（P＜0.01），与a*值呈极显著正相关（P＜0.01）。Moreno等[33]研究表明，pH值下降速率和程度与肉的品质密切相关，极限pH值越高，肉的保水能力越好，汁液损失越少，这与本文的结果一致。pH值下降速率过快，肌肉蛋白质发生变性，从而大大降低其保水能力，导致肉汁液损失严重、颜色苍白、质地松软，被称为PSE（pale, soft, and exudative）肉。相反，pH下值降速率过慢，则会造成外表干燥，质地粗硬，形成色泽深暗的DFD（dark, firm and dry）肉[34]。

糖酵解酶活力之间同样存在一定的相关性。4 ℃与-1 ℃环境下，HK活力与PFK活力呈显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.717和0.713，这与李乔等[35]的研究结论相同。糖酵解反应是一系列复杂的反应，除温度、pH值等直接影响因素外，还受底物浓度、激活剂、抑制剂等间接因素影响。HK活性受PFK活性的间接调控，因为HK活性与6-磷酸葡萄糖浓度有关，当PFK活性降低时，6-磷酸葡萄糖积累并导致HK活性下降。

3 结 论

本实验测定了猪里脊肉在冰温（-1 ℃）和冷藏（4 ℃）贮藏条件下品质指标和宰后糖酵解及相关代谢途径中9 种酶的活力变化。结果表明：-1 ℃处理组样品汁液损失率、色泽、pH值等品质指标均优于4 ℃处理组样品。贮藏初期，-1 ℃处理组的HK、PFK、LDH活力显著低于4 ℃处理组。综合各项品质指标以及酶活力指标可知，冰温通过抑制贮藏前期HK、PFK、LDH等糖酵解酶活性，减缓乳酸堆积及肉pH值降低，改善猪肉贮藏品质。虽然本实验证实了冰温可以通过影响糖酵解酶活性进而改变肉在贮藏过程中的乳酸含量、间接影响着肉品质的变化，但肉的品质还受到品种、饲养条件、屠宰方式、微生物侵染等因素的综合影响。本实验通过研究冰温贮藏对猪肉宰后品质及糖酵解途径相关酶活性的影响，揭示了冰温贮藏对猪肉宰后糖酵解代谢与品质之间影响机制，对于肉类贮藏条件的优化及贮藏过程种的代谢研究与控制具有一定参考价值，为猪肉宰后贮藏保鲜提供了指导思路。